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啮风

铜虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-06-09 23:46:50
ottolzm(金币+3): 2011-06-10 11:51:44
已知条件:目前通过异源表达了一段基因A,得到蛋白活性,这段基因A的原始来源的下游有两个反向ORF,分别执行了调控和转录调控的功能,现已证明了这两个ORF的存在对A的活性有明显的提高作用,所以想吧这两个反向ORF 也异源表达来看看是否在异源宿主里对A亦有促进作用。
问题:
(1)这两个反向ORF 和A是同基因簇来源,紧密相连,而且二者有重叠区域,那么我在做异源表达的时候是直接把这两个反向ORF 一次性的扩增出来表达呢?还是应该分别扩增,然后连接起来再去表达?
++++++++++++++++++++一这两个反向ORF位于下游,且执行转录调控功能,那么有两种可能,一个是反向ORF表达出的蛋白结合在A上游序列,起到转录调控作用,那么你可能要在A基因上游找找有没有这样的结合位点,可以通过生物信息学方法预测,如果有,那么这个调控区也得一块扩增到异源宿主里,另外一个是这两个反向ORF有助于A基因MRNA的稳定,或者说是有助于核糖体和A基因的结合,那么这个情况,一起扩增ABC这三个就可以了,启动子用宿主的。

(2)和A同基因簇来源的这两个ORF 同A的转录翻译反向相反,那么在异源表达是否应该也是反向表达,还是应该调整顺序后在进行表达?
++++++++++++++++++++++++++++++这个方向更本不用调整,当然,你可以尝试调整后,做做这个实验
(3)A基因和它下游的两个ORF 是同基因簇来源的,那么,是否意味着A的上游一些比如启动原件对于两个反向的ORF 也有作用,
+++++++++++++++++这个有可能,但是你可以用在以远宿主菌表达ABC,在以远宿主菌表达BC比较两种情况BC的活性,来初步解决这个问题,当然,正如第一个问题所说,在A的上游也可能存在BC的调控位点

还是这两个反向的ORF 的下游也有某些启动原件,那么这些启动原件如何进行分析?在做异源表达的时候是否也应该加上去?

+++++++++++++++某基因下游一般很少有该基因的启动元件,下游调控比较复杂,一般不用考虑这一步。
因为楼主给的信息,可以解释的很多,只能给出个大概我的看法,希望大家指正。

[ Last edited by 啮风 on 2011-6-9 at 23:10 ]
2楼2011-06-09 23:07:22
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