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[求助]
做过RNAi或者实时定量的同学请帮助我解决一个问题，感激不尽
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最近在做RNAi，我的实验对象是秀丽隐杆线虫，采用的干扰方式是浸泡，将体外转录获得的dsRNA通过浸泡的方式导入线虫体内，收集虫体后提取总RNA，反转录成cDNA之后做实时定量检测干扰效果。可定量结果让我很头疼，目的基因的拷贝数不仅没有降低，反而升高了。如果说目的基因的拷贝数没有明显下降，可以解释为干扰效果不好，但是目的基因的拷贝数明显上升，这怎么解释？希望高手可以帮我解释一下这个现象，感激不尽~~~ 我个人认为，可能是浸泡后的虫体内残留有dsRNA，是不是因为在进行总RNA提取和反转录的时候将残留的dsRNA也一并提出并合成了cDNA，从而导致目的基因的拷贝数增加？如果这种推测成立，那么，在提取总RNA之前应该怎样对虫体进行处理，以消除dsRNA的干扰？ 我做的是相对定量，每次都做三个重复，以管家基因的拷贝数作为标准，计算目的基因的相对含量，可是实验组的目的基因含量每次都比阴性对照组高。另外，我本次干扰一共做了三个不同的基因，貌似三个不同的基因都出现了这样的情况，让人很费解，求帮助~~~ [ Last edited by 1949stone on 2011-5-30 at 16:24 ] |
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秀丽隐杆线虫的话，用喂食的方法做RNAi更方便啊！ 把你要干扰的基因的CDS选一段约1kb的片段，克隆到L4440质粒里，再转到HT115菌株里，用来喂食线虫就可以了。L4440有两个反向的T7启动子，可以直接表达双链RNA,线虫吃进去后该双链RNA会被降解成小片段，可以介导RNA干扰的。你要好好看看Andrew Fire的文章了。L4440质粒的信息在下面： http://www.addgene.org/pgvec1?f= ... amp;identifier=1654 定量的问题也容易解决，你设计引物的时候避开你的dsRNA就可以了。让扩增的序列不在dsRNA的区域里就ok啦。 |
9楼2011-06-02 23:12:06
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简0516单(金币+5): 谢谢你的建议 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-02 23:14:56
简0516单(金币+5): 谢谢你的建议 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-02 23:14:56
| 如果重复三次都是处理组比阴性对照组高的话就应该可以排除你实验操作的误差了。你自己的怀疑有道理，想排除的话也很容易，你的对照组也用dsRNA泡一下就可以了，只不过选择的dsRNA是无义的就好了。另外还有一种可能，生物体内的基因表达是一张网络，某个基因的表达变化往往会导致其他基因的表达水品也发生变化。你应该用你的dsRNA序列去线虫基因库内blast一下，看看除了你的目的基因外，这个siRNA是否还有其他靶点，如果没有的话没问题，如果有的话就可能是其他靶基因受抑制后对你的目的基因的表达产生激活的作用。 |
8楼2011-05-31 15:16:06
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