| 查看: 2886 | 回复: 14 | |||
[求助]
做过RNAi或者实时定量的同学请帮助我解决一个问题，感激不尽
|
|||
|
最近在做RNAi，我的实验对象是秀丽隐杆线虫，采用的干扰方式是浸泡，将体外转录获得的dsRNA通过浸泡的方式导入线虫体内，收集虫体后提取总RNA，反转录成cDNA之后做实时定量检测干扰效果。可定量结果让我很头疼，目的基因的拷贝数不仅没有降低，反而升高了。如果说目的基因的拷贝数没有明显下降，可以解释为干扰效果不好，但是目的基因的拷贝数明显上升，这怎么解释？希望高手可以帮我解释一下这个现象，感激不尽~~~ 我个人认为，可能是浸泡后的虫体内残留有dsRNA，是不是因为在进行总RNA提取和反转录的时候将残留的dsRNA也一并提出并合成了cDNA，从而导致目的基因的拷贝数增加？如果这种推测成立，那么，在提取总RNA之前应该怎样对虫体进行处理，以消除dsRNA的干扰？ 我做的是相对定量，每次都做三个重复，以管家基因的拷贝数作为标准，计算目的基因的相对含量，可是实验组的目的基因含量每次都比阴性对照组高。另外，我本次干扰一共做了三个不同的基因，貌似三个不同的基因都出现了这样的情况，让人很费解，求帮助~~~ [ Last edited by 1949stone on 2011-5-30 at 16:24 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 RNAi 相关 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有292人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 过柱子问题
已经有15人回复
- 急急急-----英文论文发表，求帮助！
已经有5人回复
- 大二学生，关于专业就业方向迷茫，求各位前辈帮助解答
已经有17人回复
- 求助物质定量分析方法
已经有10人回复
- GC-MS定量测定脂肪酸时标品的问题
已经有10人回复
- 关于原子吸收分光光度法检测沉积物和海水的检出限问题
已经有7人回复
- 有配过稀碘化铋钾的同学吗？关于配置出的问题，急死了
已经有5人回复
- 关于公派回国的问题
已经有4人回复
- 请教关于拉曼光谱表面增强计算和实验问题，谢谢
已经有16人回复
- 【求助】几个关于实时定量PCR的问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】酵母PRS整合表达质粒使用的问题，我需要你的帮助，谢谢
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于RNAi的一个问题
已经有10人回复
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
|
秀丽隐杆线虫的话，用喂食的方法做RNAi更方便啊！ 把你要干扰的基因的CDS选一段约1kb的片段，克隆到L4440质粒里，再转到HT115菌株里，用来喂食线虫就可以了。L4440有两个反向的T7启动子，可以直接表达双链RNA,线虫吃进去后该双链RNA会被降解成小片段，可以介导RNA干扰的。你要好好看看Andrew Fire的文章了。L4440质粒的信息在下面： http://www.addgene.org/pgvec1?f= ... amp;identifier=1654 定量的问题也容易解决，你设计引物的时候避开你的dsRNA就可以了。让扩增的序列不在dsRNA的区域里就ok啦。 |
9楼2011-06-02 23:12:06
seahow
木虫 (著名写手)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 1691.1
- 红花: 1
- 帖子: 1778
- 在线: 65.2小时
- 虫号: 78970
- 注册: 2005-07-07
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
7楼2011-05-31 14:36:59
terry130
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 2283.9
- 散金: 19
- 红花: 9
- 帖子: 388
- 在线: 39.3小时
- 虫号: 313316
- 注册: 2007-02-24
- 性别: GG
- 专业: 细胞死亡
【答案】应助回帖
★ ★ ★
简0516单(金币+5): 谢谢你的建议 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-02 23:14:56
简0516单(金币+5): 谢谢你的建议 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-02 23:14:56
| 如果重复三次都是处理组比阴性对照组高的话就应该可以排除你实验操作的误差了。你自己的怀疑有道理，想排除的话也很容易，你的对照组也用dsRNA泡一下就可以了，只不过选择的dsRNA是无义的就好了。另外还有一种可能，生物体内的基因表达是一张网络，某个基因的表达变化往往会导致其他基因的表达水品也发生变化。你应该用你的dsRNA序列去线虫基因库内blast一下，看看除了你的目的基因外，这个siRNA是否还有其他靶点，如果没有的话没问题，如果有的话就可能是其他靶基因受抑制后对你的目的基因的表达产生激活的作用。 |
8楼2011-05-31 15:16:06
冷水清茶
捐助贵宾 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 2743.1
- 散金: 18
- 红花: 4
- 帖子: 108
- 在线: 59.4小时
- 虫号: 930732
- 注册: 2009-12-19
- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
2楼2011-05-30 08:37:40
beautybanana
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 22
- 应助: 23 (小学生)
- 贵宾: 0.02
- 金币: 2973.8
- 散金: 5088
- 红花: 26
- 帖子: 1694
- 在线: 485.8小时
- 虫号: 1142157
- 注册: 2010-11-09
- 性别: GG
- 专业: 纳米生物学
3楼2011-05-30 08:52:07
4楼2011-05-30 09:50:09
dhd997
荣誉版主 (文坛精英)
自由人，我型我秀！
- MolEPI: 5
- 应助: 24 (小学生)
- 贵宾: 4.021
- 金币: 22094.4
- 散金: 1968
- 红花: 45
- 沙发: 161
- 帖子: 22410
- 在线: 927.9小时
- 虫号: 500412
- 注册: 2008-02-13
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
- 管辖: 分子生物
5楼2011-05-30 12:43:15
冷水清茶
捐助贵宾 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 2743.1
- 散金: 18
- 红花: 4
- 帖子: 108
- 在线: 59.4小时
- 虫号: 930732
- 注册: 2009-12-19
- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
6楼2011-05-31 12:26:20
jiao63415719
银虫 (著名写手)
- 应助: 85 (初中生)
- 金币: 249.4
- 散金: 3620
- 红花: 18
- 帖子: 2688
- 在线: 756.3小时
- 虫号: 1159326
- 注册: 2010-11-30
- 性别: MM
- 专业: 食品科学基础
10楼2012-03-01 12:38:28
