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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过RNAi或者实时定量的同学请帮助我解决一个问题，感激不尽
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 做过RNAi或者实时定量的同学请帮助我解决一个问题，感激不尽

最近在做RNAi，我的实验对象是秀丽隐杆线虫，采用的干扰方式是浸泡，将体外转录获得的dsRNA通过浸泡的方式导入线虫体内，收集虫体后提取总RNA，反转录成cDNA之后做实时定量检测干扰效果。可定量结果让我很头疼，目的基因的拷贝数不仅没有降低，反而升高了。如果说目的基因的拷贝数没有明显下降，可以解释为干扰效果不好，但是目的基因的拷贝数明显上升，这怎么解释？希望高手可以帮我解释一下这个现象，感激不尽~~~
我个人认为，可能是浸泡后的虫体内残留有dsRNA，是不是因为在进行总RNA提取和反转录的时候将残留的dsRNA也一并提出并合成了cDNA，从而导致目的基因的拷贝数增加？如果这种推测成立，那么，在提取总RNA之前应该怎样对虫体进行处理，以消除dsRNA的干扰？

我做的是相对定量，每次都做三个重复，以管家基因的拷贝数作为标准，计算目的基因的相对含量，可是实验组的目的基因含量每次都比阴性对照组高。另外，我本次干扰一共做了三个不同的基因，貌似三个不同的基因都出现了这样的情况，让人很费解，求帮助~~~

[ Last edited by 1949stone on 2011-5-30 at 16:24 ]
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1楼 2011-05-30 00:00:26
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seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
简0516单(金币+5): 谢谢你的建议，我现在正在设计western的方案。 2011-05-31 15:11:55
西瓜(金币+3): 欢迎应助 2011-06-02 23:14:41
首先，确定你的实验没有误差，没有技术问题（我觉得应该没有）；同时，建议你做western ，这样才是最终结果。
第二， 你要清楚RNAi未必会抑制转录，激活转录也是可以的，这是一种反馈效应！ 所以，如果 你需要这个抑制，你应该选择其他位点设计，或许有效果。
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7楼2011-05-31 14:36:59
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冷水清茶

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 说的是有道理，欢迎多来交流哦 2011-05-30 12:42:40
沙发。不知道你做了你次重复？       提取RNA的误差，或干扰对象有弄错。   实验是允许失败的。重复性如果很好，你会有新的发现，祝贺你。
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2楼2011-05-30 08:37:40
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★
1949stone(金币+1): 是要注意 2011-05-30 16:24:14
这个好好做下重复，如果还是增加，那你得好好研究研究了，说不定另有发现~恭喜！~
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3楼2011-05-30 08:52:07
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简0516单

至尊木虫 (著名写手)
1949stone: 可以针对回答你问题的引用回复 这样他就可以收到消息 也可以直接发在原帖里 更多人可以看到 2011-05-30 16:25:40
我做的是相对定量，每次都做三个重复，以管家基因的拷贝数作为标准，计算目的基因的相对含量，可是实验组的目的基因含量每次都比阴性对照组高。另外，我本次干扰一共做了三个不同的基因，貌似三个不同的基因都出现了这样的情况，让人很费解，求帮助~~~
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4楼2011-05-30 09:50:09
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