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[求助]
做过RNAi或者实时定量的同学请帮助我解决一个问题，感激不尽
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最近在做RNAi，我的实验对象是秀丽隐杆线虫，采用的干扰方式是浸泡，将体外转录获得的dsRNA通过浸泡的方式导入线虫体内，收集虫体后提取总RNA，反转录成cDNA之后做实时定量检测干扰效果。可定量结果让我很头疼，目的基因的拷贝数不仅没有降低，反而升高了。如果说目的基因的拷贝数没有明显下降，可以解释为干扰效果不好，但是目的基因的拷贝数明显上升，这怎么解释？希望高手可以帮我解释一下这个现象，感激不尽~~~ 我个人认为，可能是浸泡后的虫体内残留有dsRNA，是不是因为在进行总RNA提取和反转录的时候将残留的dsRNA也一并提出并合成了cDNA，从而导致目的基因的拷贝数增加？如果这种推测成立，那么，在提取总RNA之前应该怎样对虫体进行处理，以消除dsRNA的干扰？ 我做的是相对定量，每次都做三个重复，以管家基因的拷贝数作为标准，计算目的基因的相对含量，可是实验组的目的基因含量每次都比阴性对照组高。另外，我本次干扰一共做了三个不同的基因，貌似三个不同的基因都出现了这样的情况，让人很费解，求帮助~~~ [ Last edited by 1949stone on 2011-5-30 at 16:24 ] |
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西瓜
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秀丽隐杆线虫的话，用喂食的方法做RNAi更方便啊！ 把你要干扰的基因的CDS选一段约1kb的片段，克隆到L4440质粒里，再转到HT115菌株里，用来喂食线虫就可以了。L4440有两个反向的T7启动子，可以直接表达双链RNA,线虫吃进去后该双链RNA会被降解成小片段，可以介导RNA干扰的。你要好好看看Andrew Fire的文章了。L4440质粒的信息在下面： http://www.addgene.org/pgvec1?f= ... amp;identifier=1654 定量的问题也容易解决，你设计引物的时候避开你的dsRNA就可以了。让扩增的序列不在dsRNA的区域里就ok啦。 |
9楼2011-06-02 23:12:06
冷水清茶
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2楼2011-05-30 08:37:40
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