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shecf

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小木虫--警长

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[交流] 琼脂糖凝胶电泳基本常识已有7人参与

琼脂糖凝胶电泳对于现在的生物学操作就是小儿科，但是下面的一些小技巧您知道吗？
1 凝胶制作
1.1 给胶补点水：在日常的实验中一般都是一次多配点凝胶，下次融后直接使用。但有没有注意随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。
补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(EB)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色。
1.2 加速凝固：一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右。
2 点样
上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×)，使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孔，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将Tip尖插至孔底。
3 电泳
电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。
4 结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样?溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5 vg／ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。
实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过20％，较小的核酸片段在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负傲移动，如果将凝胶置含EB的水溶液中30 min，较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存。
另附DNA电泳常见问题分析：

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