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linyanfei

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR3‘端扩增 已有4人参与

请各位大侠帮忙啊,我连续做了好几次3’端得扩增,用的试剂盒,都不行,到底怎么回事啊?我感觉提取的RNA质量还行,不知道哪里出了问题。我是新手,拜托老手们指导一下!谢谢啦
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
这个要一步一步检查了,既然觉得RNA不好,不如重新做。
话说,无图无真相啊~
2楼2011-05-14 00:15:41
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-14 00:15:41:
这个要一步一步检查了,既然觉得RNA不好,不如重新做。
话说,无图无真相啊~

呵呵,首先谢谢啦!我是觉得RNA质量还行,有很清晰的28s,18s和5s.然后反转录的时候也是按照说明书上的步骤来的,但是还是不行。下次做的时候我打算先在60度保温十分钟,看一下RNA有没有降解,如果是降解了做后面的似乎都是白做!
3楼2011-05-14 20:00:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-14 20:00:15:
呵呵,首先谢谢啦!我是觉得RNA质量还行,有很清晰的28s,18s和5s.然后反转录的时候也是按照说明书上的步骤来的,但是还是不行。下次做的时候我打算先在60度保温十分钟,看一下RNA有没有降解,如果是降解了做后 ...

有没有试过拿cDNA去扩内参基因?这个是检验cDNA质量常用的方法。
4楼2011-05-15 01:09:07
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-15 01:09:07:
有没有试过拿cDNA去扩内参基因?这个是检验cDNA质量常用的方法。

没有,昨天重新提取了RNA,我今天再反转录cDNA试试,如果不行的话,可能就是反转录酶有可能有问题,或者像你说的一样,做一下内参,谢谢,呵呵
5楼2011-05-15 11:35:30
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-15 11:35:30:
没有,昨天重新提取了RNA,我今天再反转录cDNA试试,如果不行的话,可能就是反转录酶有可能有问题,或者像你说的一样,做一下内参,谢谢,呵呵

你说RNA质量不错,是从胶上看的吗?有没有测OD值?
OD260测RNA的量,
260/280和260/230测质量。

如果RNA有提取试剂的污染(Trizol、苯酚等等)会严重影响反转录反应。
6楼2011-05-15 11:51:37
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friya0910

新虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-13 22:09:30:
请各位大侠帮忙啊,我连续做了好几次3’端得扩增,用的试剂盒,都不行,到底怎么回事啊?我感觉提取的RNA质量还行,不知道哪里出了问题。我是新手,拜托老手们指导一下!谢谢啦

我也遇到了这样的问题,互相交流啊!
7楼2011-05-15 16:09:40
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-05-16 16:52:44
PCR扩不出来,首先考虑的应该是PCR本身,引物通常是最大的问题,楼主说的3‘端扩增是什么意思,RACE吗?
8楼2011-05-16 15:46:16
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励分享经验 2011-05-16 16:52:52
3'很容易啊,如果用试剂盒的,都是一次就出来的.
5'就没有那么好做了
9楼2011-05-16 16:11:27
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-15 16:09:40:
我也遇到了这样的问题,互相交流啊!

呵呵,我已经扩出来了,连续几次失败之后终于看见了点光明啊,你要加油哦
10楼2011-05-16 21:57:33
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