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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR3‘端扩增
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR3‘端扩增 已有4人参与

请各位大侠帮忙啊，我连续做了好几次3’端得扩增，用的试剂盒，都不行，到底怎么回事啊？我感觉提取的RNA质量还行，不知道哪里出了问题。我是新手，拜托老手们指导一下！谢谢啦
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1楼 2011-05-13 22:09:30
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
这个要一步一步检查了，既然觉得RNA不好，不如重新做。
话说，无图无真相啊~
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2楼2011-05-14 00:15:41
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-14 00:15:41:
这个要一步一步检查了，既然觉得RNA不好，不如重新做。
话说，无图无真相啊~

呵呵，首先谢谢啦！我是觉得RNA质量还行，有很清晰的28s,18s和5s.然后反转录的时候也是按照说明书上的步骤来的，但是还是不行。下次做的时候我打算先在60度保温十分钟，看一下RNA有没有降解，如果是降解了做后面的似乎都是白做！
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3楼2011-05-14 20:00:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-14 20:00:15:
呵呵，首先谢谢啦！我是觉得RNA质量还行，有很清晰的28s,18s和5s.然后反转录的时候也是按照说明书上的步骤来的，但是还是不行。下次做的时候我打算先在60度保温十分钟，看一下RNA有没有降解，如果是降解了做后 ...

有没有试过拿cDNA去扩内参基因？这个是检验cDNA质量常用的方法。
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4楼2011-05-15 01:09:07
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-15 01:09:07:
有没有试过拿cDNA去扩内参基因？这个是检验cDNA质量常用的方法。

没有，昨天重新提取了RNA，我今天再反转录cDNA试试，如果不行的话，可能就是反转录酶有可能有问题，或者像你说的一样，做一下内参，谢谢，呵呵
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5楼2011-05-15 11:35:30
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-15 11:35:30:
没有，昨天重新提取了RNA，我今天再反转录cDNA试试，如果不行的话，可能就是反转录酶有可能有问题，或者像你说的一样，做一下内参，谢谢，呵呵

你说RNA质量不错，是从胶上看的吗？有没有测OD值？
OD260测RNA的量，
260/280和260/230测质量。

如果RNA有提取试剂的污染（Trizol、苯酚等等）会严重影响反转录反应。
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6楼2011-05-15 11:51:37
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by linyanfei at 2011-05-13 22:09:30:
请各位大侠帮忙啊，我连续做了好几次3’端得扩增，用的试剂盒，都不行，到底怎么回事啊？我感觉提取的RNA质量还行，不知道哪里出了问题。我是新手，拜托老手们指导一下！谢谢啦

我也遇到了这样的问题，互相交流啊！
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7楼2011-05-15 16:09:40
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-05-16 16:52:44
PCR扩不出来，首先考虑的应该是PCR本身，引物通常是最大的问题，楼主说的3‘端扩增是什么意思，RACE吗？
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8楼2011-05-16 15:46:16
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励分享经验 2011-05-16 16:52:52
3'很容易啊,如果用试剂盒的,都是一次就出来的.
5'就没有那么好做了
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9楼2011-05-16 16:11:27
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-15 16:09:40:
我也遇到了这样的问题，互相交流啊！

呵呵，我已经扩出来了，连续几次失败之后终于看见了点光明啊，你要加油哦
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10楼2011-05-16 21:57:33
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