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yingcun

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于毕赤酵母

毕赤酵母GS115菌落PCR，网上查到微波炉法和水浴法。直接挑菌体在EP管微波炉加热5min，pcr后跑出的胶什么都没有； 还试过把液体菌水浴加热，但还是pcr后什么条带都出不来。到底是为什么？或者还有什么方法么？
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1楼 2011-05-05 16:41:02
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-05 16:51:26
yingcun(金币+2): 2011-05-07 09:50:21
挑取菌落于无菌水中稀释，99°水浴5分钟后立即放-80冰箱放置10min,重复三次。如果还想效果好点，建议99°水浴前先加Zymolyase或溶菌酶37°反应至少半小时。
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仕不可不弘毅，任重而道远
2楼2011-05-05 16:47:54
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yingcun

新虫 (初入文坛)
是不是水浴法效果不好？还是的确做不出来？
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3楼2011-05-05 16:53:34
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-06 08:46:31
引用回帖:
Originally posted by yingcun at 2011-05-05 16:41:02:
毕赤酵母GS115菌落PCR，网上查到微波炉法和水浴法。直接挑菌体在EP管微波炉加热5min，pcr后跑出的胶什么都没有； 还试过把液体菌水浴加热，但还是pcr后什么条带都出不来。到底是为什么？或者还有什么方法么？

推荐煮一冻一煮法。
将1mL菌液2 500 X g离心5 min,弃上清，沉淀中加入500 uL TE悬浮沉淀，2500Xg离心3m in;弃上清，重复一次，最后沉淀溶于100 uLTE,沸水浴10 min，-20℃冷冻30 min,再次沸水浴10 min,2 500 X g离心5 min,取上清为模板作PCR。
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4楼2011-05-06 07:42:41
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hulanzi

新虫 (初入文坛)
我是直接挑毕赤酵母菌斑，直接加到pcr体系里，先能扩出来，后来就不知道为什么扩不出来了
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5楼2011-06-10 16:27:07
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): ok 2011-09-05 22:11:51
引用回帖:
1楼: Originally posted by yingcun at 2011-05-05 16:41:02:
毕赤酵母GS115菌落PCR，网上查到微波炉法和水浴法。直接挑菌体在EP管微波炉加热5min，pcr后跑出的胶什么都没有； 还试过把液体菌水浴加热，但还是pcr后什么条带都出不来。到底是为什么？或者还有什么方法么？

酵母壁厚，通常要提取基因组然后再PCR验证的。先离心收集菌体，用1mg/ml的溶菌酶37度温育30min，然后加入DNA裂解液（含有SDS），用液氮研磨。60度放置1小时，然后用等体积的氯仿抽提一次，取上清加入等体积的异丙醇-20度沉淀1-2小时，离心，用70%的乙醇洗沉淀一次，吹干后用无菌水重悬，得到酵母基因组，然后就可以用通用引物或者自己的引物就可以PCR验证了。
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6楼2011-09-05 21:48:30
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