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[求助] 蛋白酶水解实验设计方案讨论

实验需要用商用蛋白酶(枯草杆菌提取的混合蛋白酶)对常见的几种蛋白质进行水解，并找出最佳水解条件，目标是实现完全眉水解。实验方案是在50度下pH=8左右向标准牛血清蛋白或者酪蛋白溶液引入蛋白酶溶液（磷酸氢钾缓冲溶液中加入2mMCaCl2作为辅酶），水解24h后，加入三氯乙酸溶液（最终工作浓度为7.5%， v/w）将未水解的蛋白质沉淀，然后过0.45滤膜后测定滤液中的总氮。根据水解后滤液中测定的氮与原标准蛋白溶液的总氮的比值计算作为蛋白酶水解的氮回收率（方法是过硫酸钾氧化测定总氮法）。
现在实验结果遇到几个问题：
1.请问从整个实验方案看来，有无硬伤比较不合理的地方？
2.初始标准蛋白浓度约为12 mg/L(v/w)，为何加入三氯乙酸溶液后，整个体系无絮状沉淀，滤膜上也没有可见沉淀，是因为蛋白浓度太低导致沉淀下来的蛋白肉眼无法看到吗？当然我需要做一组对比验证无蛋白酶添加下初始蛋白是否能全部沉淀。
3.做了预实验，发现最终蛋白酶工作浓度在0.5 units/ml下，氮的回收率仍较低，只有10%左右，原因一直没想明白。。请问理论条件下，加入足够的蛋白酶，是不是能达到近乎100%的氮回收率？看到有一些文献报道在鱼肉提取蛋白中加入蛋白酶水解，其氮回收率可以达到90%以上。
想请大家帮我解答下，谢谢各位学长指导！感激不尽！谢谢！

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