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melodyxin

铜虫 (小有名气)

[求助] 求问一个百思不得其解的问题！

在做某个纤维素酶基因的大肠杆菌胞内表达和毕赤酵母中的胞外表达，都实现了预期目标，可是在测定比活力（IU/mg）时发现一个奇怪的现象：

大肠杆菌表达为胞内，因此采用冻融破胞后，测定破胞液的总蛋白量，计算比活力；而毕赤酵母表达是胞外分泌，因此直接取发酵上清液测定总蛋白量计算比活力。计算结果，后者是前者的一半！

这个这么解释啊？一般来说，酵母表达体系不是更有利于外源基因的表达吗？怎么比活力反而会低于细菌呢？

P.S.该目的基因富含AT，来自真菌
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1楼 2011-04-22 21:54:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
1949stone: 这个没有奖励啊 2011-04-23 10:57:40
纯属猜测，不应助，仅供参考
可能是酵母胞内还有蛋白吧。试试把酵母液破胞后再测。
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2楼2011-04-22 22:00:58
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 鼓励 2011-04-23 10:57:51
我就我的知识说点自己的想法。虽然目的基因来自真核细胞，在原核细胞上实现表达比较困难，因为原核细胞没有真核基因表达所需的一些调控序列。但是一旦发生了表达了，我们就不应该考虑这方面的因素了，而应该从你提取这种蛋白的方法等上面找原因了。或者有偶然因素在里面，比如，存在基因多拷贝呢？希望高人指正！！
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坚持，一秒钟，就离，成功，近一步！
3楼2011-04-22 22:28:31
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 有道理 2011-04-23 10:58:00
我觉得可能是与酶的催化条件有关，包内分泌裂解后整体水平应该为生理水平，相对的的酶活应该属于生理水平上的，但分泌到胞外后，培养基的离子浓度，PH值可能不能使酶活达到最高，因此出现上述的情况。
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4楼2011-04-22 22:32:02
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 蓝月望宁 at 2011-04-22 22:28:31:
我就我的知识说点自己的想法。虽然目的基因来自真核细胞，在原核细胞上实现表达比较困难，因为原核细胞没有真核基因表达所需的一些调控序列。但是一旦发生了表达了，我们就不应该考虑这方面的因素了，而应该从你提 ...

拷贝数的可能性不大啊，因为酵母重组菌株也是筛选过的。。。
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5楼2011-04-22 23:04:37
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2011-04-22 22:32:02:
我觉得可能是与酶的催化条件有关，包内分泌裂解后整体水平应该为生理水平，相对的的酶活应该属于生理水平上的，但分泌到胞外后，培养基的离子浓度，PH值可能不能使酶活达到最高，因此出现上述的情况。

培养基离子浓度。。。。那也不该相差这么大啊~~~

什么叫做生理水平？
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6楼2011-04-22 23:05:25
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 最近很活跃 鼓励 2011-04-23 10:58:17
酶活一般还是需要最适条件的，只有在接近生理的离子浓度（包括可能要发挥酶活的金属离子，我查了一下，纤维素酶可以在铁离子存在下激活，具体的什么你可以再去查）细胞胞浆内这些例子是存在的，但是你的配养基中是否存在这些离子？同时培养基的PH值是否是其最适的？是否与其最适PH相差很远？有时候差1都会影响很大的酶活。
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7楼2011-04-22 23:30:49
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
只是因为酶活条件吗？
会不会是密码子偏好性的关系？
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8楼2011-04-23 16:05:25
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-23 16:51:23
引用回帖:
Originally posted by melodyxin at 2011-04-22 21:54:19:
在做某个纤维素酶基因的大肠杆菌胞内表达和毕赤酵母中的胞外表达，都实现了预期目标，可是在测定比活力（IU/mg）时发现一个奇怪的现象：

大肠杆菌表达为胞内，因此采用冻融破胞后，测定破胞液的总蛋白量，计算 ...

酶的活性跟除了跟表达量，最主要的还是跟其形成的空间结构有关的，同样表达量的酶空间结构不同，活性自然相差很远了。猜测是你的酶在大肠杆菌中更有利于正确折叠，形成有活性的空间结构。优化表达条件后可能情况会改变的。
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9楼2011-04-23 16:16:29
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
嗯好的，谢谢
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10楼2011-04-24 13:56:30
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