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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 关于MTT加液与弃液的一些思考与疑问
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xiajing_acm

新虫 (小有名气)

[求助] 关于MTT加液与弃液的一些思考与疑问

给位大侠：

你们好，小弟要着手MTT，里面有些问题不太清楚，请给位指点：

1、种板时我每孔打算加100μl 共5000个左右细胞，等细胞贴壁后需不需要把培养液吸出之后再加入100μl

的药液呢？我看有的资料上说直接加入100μl药液维持到200μl的体系，可是我是按照100μl体系来算的加药量啊，如果不吸走里面原有的100μl培养液的话，那我的药物浓度岂不被稀释了一倍吗？

2、加药处理适当时间后，在加MTT需不需要把里面的培养液吸出来呢？若吸出来的话，那么是直接加入20μl 的5mg/ml的MTT呢，还是需要加入180μl新鲜的培养液+20μl 5mg/ml的MTT呢？是用含血清的培养基还是不含血清的？

3、加DMSO之前需要吸走培养液吧？给位战友是怎么操作才能保证不把甲瓒结晶吸走呢？需要在平板离心机上离心吗？

4、上酶标仪检测波长到底选择多少合适呢？490还是570nm呢？还需要设630nm参比波长吗？参比波长作用是什么呢？怎么用它的数据呢？

非常感谢各位大侠，盼早日解决！祝各位一切顺利！
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1楼2011-04-21 16:50:25
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吖漾

银虫 (小有名气)
同问！！
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2楼2011-04-22 09:08:50
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010.zilong

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢回帖！ 2011-04-24 19:07:52
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:28
qinhy(EPI+1): O(∩_∩)O谢谢 2011-05-01 08:01:45
1.这个主要看你的药物性质以及培养时间,因为在培养基中存在的血清,成分复杂,有时会干扰MTT结果,所以需要吸出原培养液后再给药,但也有一种可能,即培养时间比较长,细胞个数大则会把培养液中所含有的血清消耗掉,这样就不用换液了,对于后半个问题,你加倍浓度不就OK了吗?
2.如果细胞帖的紧,一般来说要把原液吸出去,否则MTT会与一些药物形成二聚体影响结果.用不含血清的培养基采用后一种办法加入.
3.这个是肯定得吸走的啊,我做过SY5Y,直接把板子倒过来,扣去液体即可.没试过离心,但原理上应该可以.
4.不需要参比波长,490-570都行,看你的颜色深浅而定
仅供参考嘿嘿
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3楼2011-04-22 14:21:57
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xiajing_acm

新虫 (小有名气)
非常感谢！
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4楼2011-04-22 15:07:37
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wenzhiren

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:01:56
引用回帖:
Originally posted by xiajing_acm at 2011-04-21 16:50:25:
给位大侠：

你们好，小弟要着手MTT，里面有些问题不太清楚，请给位指点：

1、种板时我每孔打算加100μl 共5000个左右细胞，等细胞贴壁后需不需要把培养液吸出之后再加入100μl

的药液呢？我看有的资料上 ...

1、你可以吸出50，再加入50ul新的培养基，其中药物浓度翻倍。
2、一般不用吸出原来的培养基，直接加入10ulMTT即可。
3、这个问题要看细胞贴壁牢固程度了，想前面那位大侠，细胞贴壁牢固，直接把板反过来，下面垫无菌吸纸，培养基就会被自动吸走；如果细胞贴壁不牢固，那你就要考虑把板倾斜了，把其中的培养基轻轻吸出来，但是要注意，tips头部不要碰到板的地步，否则会吧细胞粘下来。还有些悬浮细胞MTT时，直接往里面加入裂解液了，也是可以把甲瓒溶解的。
4，一般选择490nm波长。
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5楼2011-04-22 15:47:07
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Chlo_Q

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢您的回复！ 2011-04-24 19:08:12
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:39
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:02:06
首先，我也考虑过这个问题1，最后的解决方案是将药物配成100倍液，加的时候我就直接往100里加1微升了。主要考虑的不是药的浓度问题，因为这要确定好之后才好配的，而是控制变量的问题，体积大了，细胞的环境就不同了。。。
2.MTT的原理你有没有了解，它是靠活细胞的酶反应，我认为，不要饿着它了，原来是什么培养液就继续用那个，如果不是培养了太久，就直接加MTT了（除非，你的药物具有还原性！！）
3.论坛里有一帖，很详细的讲了MTT法，里面有，建议搜一下看看，我看了很受用
4.我用着的是570测定，630参比。没方法，还是贴个链接你吧，http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/17544_1.htm
其他论坛上的，说法有多种，仅供参考
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你的理想是什么？你能为你的理想做什么？为了你的理想你能放弃什么？
6楼2011-04-24 11:06:19
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xiangf

金虫 (小有名气)
学习了，
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7楼2011-08-20 14:04:34
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