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xiajing_acm新虫 (小有名气)
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[求助]
关于MTT加液与弃液的一些思考与疑问
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给位大侠： 你们好，小弟要着手MTT，里面有些问题不太清楚，请给位指点： 1、种板时我每孔打算加100μl 共5000个左右细胞，等细胞贴壁后需不需要把培养液吸出之后再加入100μl 的药液呢？我看有的资料上说直接加入100μl药液维持到200μl的体系，可是我是按照100μl体系来算的加药量啊，如果不吸走里面原有的100μl培养液的话，那我的药物浓度岂不被稀释了一倍吗？ 2、加药处理适当时间后，在加MTT需不需要把里面的培养液吸出来呢？若吸出来的话，那么是直接加入20μl 的5mg/ml的MTT呢，还是需要加入180μl新鲜的培养液+20μl 5mg/ml的MTT呢？是用含血清的培养基还是不含血清的？ 3、加DMSO之前需要吸走培养液吧？给位战友是怎么操作才能保证不把甲瓒结晶吸走呢？需要在平板离心机上离心吗？ 4、上酶标仪检测波长到底选择多少合适呢？490还是570nm呢？还需要设630nm参比波长吗？参比波长作用是什么呢？怎么用它的数据呢？ 非常感谢各位大侠，盼早日解决！祝各位一切顺利！ |
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wenzhiren
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5楼2011-04-22 15:47:07
010.zilong
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【答案】应助回帖
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karl2100(金币+1): 谢谢回帖！ 2011-04-24 19:07:52
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:28
qinhy(EPI+1): O(∩_∩)O谢谢 2011-05-01 08:01:45
karl2100(金币+1): 谢谢回帖！ 2011-04-24 19:07:52
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:28
qinhy(EPI+1): O(∩_∩)O谢谢 2011-05-01 08:01:45
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1.这个主要看你的药物性质以及培养时间,因为在培养基中存在的血清,成分复杂,有时会干扰MTT结果,所以需要吸出原培养液后再给药,但也有一种可能,即培养时间比较长,细胞个数大则会把培养液中所含有的血清消耗掉,这样就不用换液了,对于后半个问题,你加倍浓度不就OK了吗? 2.如果细胞帖的紧,一般来说要把原液吸出去,否则MTT会与一些药物形成二聚体影响结果.用不含血清的培养基采用后一种办法加入. 3.这个是肯定得吸走的啊,我做过SY5Y,直接把板子倒过来,扣去液体即可.没试过离心,但原理上应该可以. 4.不需要参比波长,490-570都行,看你的颜色深浅而定 仅供参考嘿嘿 |
3楼2011-04-22 14:21:57
Chlo_Q
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【答案】应助回帖
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karl2100(金币+1): 谢谢您的回复！ 2011-04-24 19:08:12
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:39
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:02:06
karl2100(金币+1): 谢谢您的回复！ 2011-04-24 19:08:12
xiajing_acm(金币+5): 2011-04-27 19:42:39
qinhy(EPI+1): 2011-05-01 08:02:06
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首先，我也考虑过这个问题1，最后的解决方案是将药物配成100倍液，加的时候我就直接往100里加1微升了。主要考虑的不是药的浓度问题，因为这要确定好之后才好配的，而是控制变量的问题，体积大了，细胞的环境就不同了。。。 2.MTT的原理你有没有了解，它是靠活细胞的酶反应，我认为，不要饿着它了，原来是什么培养液就继续用那个，如果不是培养了太久，就直接加MTT了（除非，你的药物具有还原性！！） 3.论坛里有一帖，很详细的讲了MTT法，里面有，建议搜一下看看，我看了很受用 4.我用着的是570测定，630参比。没方法，还是贴个链接你吧，http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/17544_1.htm 其他论坛上的，说法有多种，仅供参考 |
6楼2011-04-24 11:06:19
