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金虫 (正式写手)

[交流] 特定蛋白表达 已有2人参与

我对某个功能蛋白感兴趣,利用分析手段纯化研究他的相关性质,
在gene bank上找到它的对应基因后,要克隆 表达等分子手段,恳请那位大哥大姐给条详细的技术路线,
已获知这个功能基因序列,及有全基因序列及提取产物,
以后该怎么办呢
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天天如此耶!!!
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好!

优秀版主优秀版主

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): 2011-04-20 13:48:53
2楼基本上是正解。但是楼主记得明白每部怎么选择。看您专业不是分子生物学,所以可能会需要学习的东西很多。
比如,为什么先连接T载体,后连接表达载体。2者什么区别。
第二,添加his标签,还是使用GST标签。这些看自己。
第三,宿主和载体的配套。Rosseta, BL21等等。
第四,诱导表达会遇见不少问题,比如诱导温度,时间,诱导剂浓度。
同时最麻烦的就是如果不可溶表达。面临着包涵体 的很多问题需要考虑。
基本上从上游到下游纯化出来,基本上要求不严格的话一个硕士可以毕业了。

[ Last edited by beibei9535 on 2011-4-20 at 13:02 ]
最好的年龄是,那一天,终于知道并且坚信自己有多好,不是虚张,不是夸浮,不是众人捧,是内心明明澈澈知道:是的,我就是这么好。
4楼2011-04-20 12:59:51
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+5, EPI+1): 牛,精辟 2011-04-20 10:55:15
已有功能基因序列好办,先分析该基因序列,设计PCR引物,PCR获得编码基因,连接到T载体测序证实;后面看你要表达在什么宿主了,连入特定的表达载体,如果要分离纯化的话可以考虑加入HIS-TAG纯化标签(有些载体上就带的),转化宿主细胞,筛选,诱导表达,然后分离纯化出功能蛋白。
以上是基本流程,具体方案还要涉及到你的基因情况、载体情况等等。
2楼2011-04-20 10:53:04
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金虫 (正式写手)

呵呵 还是楼上高明 我是生物化工的 分子接触的相当相当少 只是实验用到了这一部分才想着学学
天天如此耶!!!
5楼2011-04-21 10:55:10
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金虫 (正式写手)

我的实验目的就是对功能酶学性质的研究,蛋白降解菌已筛选,DNA已提取,功能酶DAN片段(Jsa)也能从genebank查到
最后就是想得到Jsa的表达蛋白,研究其酶学性质
我写的的工科 这方面没怎么学过 见笑了
天天如此耶!!!
6楼2011-04-21 11:02:25
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