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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】冰冻切片免疫荧光观察肿瘤血管
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wah235

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】冰冻切片免疫荧光观察肿瘤血管

各位朋友大家好，我想对肿瘤血管进行免疫荧光观察。过程：先进行心脏灌注以免血液影响；4%多聚甲醛固定；切片；观察。也有灌注完之后直接冰冻切片，是不是有冰晶干扰观察？固定怎么办？
我都糊涂了，不知道该怎么办？请教明白人，谢谢。
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1楼 2011-04-15 17:05:52
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wah235(金币+2): 谢谢，很详细 2011-04-16 16:51:40
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-17 14:26:15
引用回帖:
Originally posted by wah235 at 2011-04-15 17:05:52:
各位朋友大家好，我想对肿瘤血管进行免疫荧光观察。过程：先进行心脏灌注以免血液影响；4%多聚甲醛固定；切片；观察。也有灌注完之后直接冰冻切片，是不是有冰晶干扰观察？固定怎么办？
我都糊涂了，不知道该怎么 ...

是的
冰冻切片有人就是灌注完了就直接切片的
但是要求时间要抓紧的
就是灌注完了立刻切片
这种方法就是抗原保护得特别好
但是容易被酶降解
所以要求切片速度
还要求切片手法要好
因为没固定脱水的组织特别软
比较难切的
但是不用考虑冰晶的
因为冰晶是在-40度才大量产生
而冰冻切片一般是在-20至-25度完成的

但是要是灌注后固定在切片的话
就是可以让组织充分固定
抗原蛋白可以长期存在
可以报组织保存在-20至-80度
慢慢切片至最好效果
然后染色
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2楼2011-04-16 10:58:39
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wah235

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-16 10:58:39:
是的
冰冻切片有人就是灌注完了就直接切片的
但是要求时间要抓紧的
就是灌注完了立刻切片
这种方法就是抗原保护得特别好
但是容易被酶降解
所以要求切片速度
还要求切片手法要好
因为没固定脱水的组织特 ...

请问，灌注完固定组织，是不是得用蔗糖除水？4%多聚甲醛作为固定液，会不会干扰荧光测定，有人说多聚甲醛有荧光。
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3楼2011-04-16 16:54:58
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-04-17 14:26:27
wah235(金币+2): 2011-04-17 19:50:39
引用回帖:
Originally posted by wah235 at 2011-04-16 16:54:58:
请问，灌注完固定组织，是不是得用蔗糖除水？4%多聚甲醛作为固定液，会不会干扰荧光测定，有人说多聚甲醛有荧光。

恩
是的
灌注玩固定组织是要要蔗糖脱水的
一般脱水程序为10%15%20%各30分钟-1小时
具体情况看你组织的年龄选择
一般是年龄老点组织脱水时间稍微长点

是的4%的PFA是要残留醛基回产生干扰荧光的
很讨厌
但是
有一种神奇的东东回消除醛基的影响
它就是神奇的醛基荧光消除液
具体的参照分子克隆实验指南下册
我只记得在下册
具体的配方忘了
好像是tris-hcl和nacl
效果很好的
我们一直在用的
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4楼2011-04-17 09:57:58
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
wah235(金币+2): 2011-04-17 19:50:32
中午给你查了一下
是50mmol/L的tris-cl和100mmol/L的NaCl
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5楼2011-04-17 17:17:14
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wah235

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-17 17:17:14:
中午给你查了一下
是50mmol/L的tris-cl和100mmol/L的NaCl

ph7.4,是吧。那要怎么操作呢？将切片泡在这个溶液中？多久？谢谢你的详细解答。
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6楼2011-04-18 11:16:31
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wah235(金币+1): 2011-04-18 16:51:14
dhd997(金币+5): good 2011-04-18 18:48:57
引用回帖:
Originally posted by wah235 at 2011-04-18 11:16:31:
ph7.4,是吧。那要怎么操作呢？将切片泡在这个溶液中？多久？谢谢你的详细解答。

要求tris-cl的PH是8.0的
先配到PH是8.0的1M的tris-cl
NaCl也是先配到浓度高的
然后稀释到50mmol/L的tris-cl以及100mmol/LNaCl就行了

组织固定以后
用淬灭液冲洗一下
然后用淬灭液充分洗涤5分钟

然后再接下去按正常的做如：通透呀、过氧化氢处理呀、、、
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7楼2011-04-18 15:51:49
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