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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】发酵液除蛋白方法
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lhj_890

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】发酵液除蛋白方法

做酵母菌培养，用HPLC测定其发酵液中的代谢产物的量，需要预处理将发酵液中的蛋白除去，想问问大家都是怎样处理的？注：发酵液中有酵母膏，蛋白胨
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1楼2011-03-23 08:40:25
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lhj_890

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by h0per at 2011-03-28 20:44:09:
这些蛋白在液相检测中，也和你的目的物具有同样的吸收波长吗？
如果不是，就没必要除去，过下膜，不堵柱子就ok了。

0.22um的滤膜能除蛋白吗？
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7楼2011-03-29 07:54:56
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普通回帖

wallacelzh

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
lhj_890(金币+1): 2011-03-23 13:40:10
scelab(金币+5): 谢谢交流 2011-03-23 15:32:31
如果要测定的代谢产物是小分子物质，可以用透析的方法；

如果要测定的代谢产物是非蛋白质的大分子物质，可以使用选择性的蛋白质沉淀剂，也可以用层析；

如果要测定的代谢产物是蛋白质，建议浓缩后用电泳或层析进行分离。
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2楼2011-03-23 09:35:31
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lhj_890

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wallacelzh at 2011-03-23 09:35:31:
如果要测定的代谢产物是小分子物质，可以用透析的方法；

如果要测定的代谢产物是非蛋白质的大分子物质，可以使用选择性的蛋白质沉淀剂，也可以用层析；

如果要测定的代谢产物是蛋白质，建议浓缩后用电泳或层 ...

测定的是小分子物质，但是需要用液相测定，透析方法是不是有些慢呢？
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3楼2011-03-23 13:41:53
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yyw30000

铜虫 (小有名气)
lhj_890(金币+1): 2011-04-25 16:55:24
如果透析方法可行就要用，不要贪快而目的达不到
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4楼2011-03-23 17:46:00
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h0per

金虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2): 谢谢交流 2011-03-28 22:22:26
lhj_890(金币+1): 2011-04-25 16:54:16
这些蛋白在液相检测中，也和你的目的物具有同样的吸收波长吗？
如果不是，就没必要除去，过下膜，不堵柱子就ok了。
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5楼2011-03-28 20:44:09
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propanediol

银虫 (正式写手)
lhj_890(金币+1): 2011-03-29 07:55:10
lhj_890(金币+1): 2011-04-25 16:54:25
做液相色谱的话对蛋白没有特别要求，

一般检测发酵液中的代谢产物含量，采用如下处理方式：
1 离心取出具体和大分子 8000-15000 rpm
2 （可选）0.45u的膜过滤

HPLC柱子能够耐受上述处理后的蛋白含量
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6楼2011-03-29 07:29:43
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propanediol

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lhj_890 at 2011-03-29 07:54:56:
0.22um的滤膜能除蛋白吗？

能除菌体，大分子蛋白也可以。

但是，0.22um的膜过滤发酵液会很困难。

效果不理想，容易堵塞。
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8楼2011-03-29 12:18:49
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lhj_890

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by propanediol at 2011-03-29 12:18:49:
能除菌体，大分子蛋白也可以。

但是，0.22um的膜过滤发酵液会很困难。

效果不理想，容易堵塞。

谢谢哈，呵呵
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9楼2011-03-29 15:17:28
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微冷

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做类似的实验，导师说蛋白会堵柱子，所以担心除的不干净，


我用的方法是加3倍体积95%乙醇沉淀

请问这样可行吗
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10楼2014-07-12 00:34:50
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xuyunjian

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一。蛋白质沉淀方法1.中性盐盐析法⑴在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ks”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）2.等电点沉淀法蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。3.有机溶剂沉淀法许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。4.非离子型聚合物沉淀法20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。5.金属沉淀法    能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；    能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；    与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。   实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。6.亲和沉淀初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；所得沉淀物用一生中适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。7.选择性变性沉淀法（1）例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。（2）根据欲分离物质所含杂质的特性，通过改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而被除去。8.反胶束萃取蛋白质菌体细胞提取固液分离是生物产品生产中的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需进行固液分离。发酵液由于种类多、粘度大及成分复杂，其固液分离最为困难。固液分离的方法很多，生物工业中常规的方法有分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的方法主要是离心分离和过滤。二。超滤膜滤去。
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11楼2014-07-16 13:56:45
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