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生兴生物

银虫 (小有名气)

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[交流] 【分享】蛋白定量小结已有2人参与

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量；为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量；为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。
现今有很多商品化的蛋白定量试剂盒，如BCA定量试剂盒等，操作起来，简便快捷。当然也有不少实验室，还是采用传统的方法进行蛋白定量。现将蛋白定量过程中所遇的一些问题小结一下。
Q1: 采用考马斯亮蓝G-250法进行蛋白定量实验，制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？
A1: 将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。
Q2: 采用Bradford法进行蛋白定量，样品中一般含哪些物质对此法有干扰，哪些物质对此法干扰很小或没有干扰？
A2: 一般来说，样品中如含有K+ 、Na+ 、Mg2+、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法；但仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
Q3: 采用考马斯亮蓝蛋白定量法（Bradford法）测定蛋白含量，实验可能遇到的问题、原因及解决办法
问题：空白吸收好，但是标准品和样品数值比预期小
原因：1.试剂储存不当；解决：试剂应冷藏
2.试剂冷；解决：室温温育
3.错误波长；解决：595nm测量
问题：空白和标准品吸收好，但是样品数值比预期小
原因：蛋白质分子量小于3000；解决：改用BCA法
问题：有沉淀形成
原因：1.样品中有去污剂；解决：透析或稀释样品。
2.样品没有充分混合，反应时间太长；解决：立即混合，测量
问题：所有反应颜色深
原因：1.强碱性条件；解决：透析或稀释样品
2.样品体积太大，导致PH升高；解决：去除干扰物质
问题：需要在不同波长测量
原因：没有相应595nm滤光片；解决：可以在575－615nm之间测量，但是灵敏度会降低
Q4: 采用BCA蛋白定量法测定蛋白含量时，实验可能遇到的问题、原因及解决办法
问题: 无颜色反应
原因：样品中有铜螯合剂；解决：1.透析，脱盐或稀释样品；2.增加工作液铜离子浓度（50：2）3.去除干扰物质
问题: 空白吸收好，但是标准品和样品颜色反应浅
原因：1.强酸或强碱改变了工作液PH值；解决：透析，脱盐或稀释样品
2. 测量波长错误；解决：562nm检测
问题: 样品颜色比较深
原因：1.蛋白浓度太高；解决：稀释样品
2.样品中有脂或脂蛋白；解决：加2％SDS
问题: 所有反应颜色深
原因：1.缓冲液有还原剂；解决：透析或稀释样品
2.缓冲液有巯基；解决：去除干扰物质
问题：需要在不同波长测量
原因：没有相应滤光片；解决：可以在540-590nm之间测量，但是灵敏度会降低

[ Last edited by 生兴生物 on 2011-3-21 at 15:36 ]

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