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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】TAIL-PCR 问题
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zhouheyi_2

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】TAIL-PCR 问题

你好！我时植物所研二的学生。我最近在做TAIL-PCR扩增未知序列。我的体系如下：第一轮为25μL体系，其中gDNA 30ng 左右，dNTP 200μM，GC buffer 12.5μL，primer 0.15μM,随机引物为1μM。
第一轮的图如下：




1kb



第二轮为25μL体系，其中包括将第一轮产物稀释50倍，取1μL，dNTP 200μM，GC buffer 12.5μL，两个primer 0.15μM。图如下：



1kb


我想请问您是否遇到过这样的情况吗？我扩了很多次，可是都是这样，不知道究竟哪里有问题，不知道应该在那些地方改进。迫切希望得到您的指点。




关于Primer，我曾经用过这几个引物，扩出的第二轮条带如下：




      1kb
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1楼 2011-03-12 22:16:24
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
zhouheyi_2(金币+1): 2011-03-13 14:36:37
第一步基因组DNA是不是太多了?
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2楼2011-03-12 22:47:20
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zhouheyi_2

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhouheyi_2 at 2011-03-12 22:16:24:
你好！我时植物所研二的学生。我最近在做TAIL-PCR扩增未知序列。我的体系如下：第一轮为25μL体系，其中gDNA 30ng 左右，dNTP 200μM，GC buffer 12.5μL，primer 0.15μM,随机引物为1μM。
第一轮的图如下：

...

我也有稀释过DNA约1倍左右，跑出来也是这样的图
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3楼2011-03-13 14:36:18
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pangzio

铁虫 (小有名气)

关于Tail-pcr

zhouheyi_2(金币+1): 2011-03-14 16:02:44
zhouheyi_2(金币+2): 2011-03-14 16:03:34
做Tail-PCR最好将你的基因组DNA提的质量好些，杂质去的干净一点。DNA可以少加一点，可以做几个浓度低度的摸索一下。对第一轮的条件好好的摸索一下，如果第一轮和第二轮扩增不出较清晰的、多条带的产物，就不要做第三轮的P了。
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4楼2011-03-14 03:47:55
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kdfight

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我第一轮有带，但二、三轮同楼主的一样，是全弥散的，怎么回事呢
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5楼2011-06-01 16:42:48
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zhouheyi_2

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by kdfight at 2011-06-01 16:42:48:
我第一轮有带，但二、三轮同楼主的一样，是全弥散的，怎么回事呢

我也出现过这种情况，至今没有解决，不知道你找到原因没？
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6楼2011-06-03 12:08:02
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sunwei57

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这是一个无解的题,很难找到真正的原因,我们遇到过多次也曾经问过刘耀光,他说他们从没遇到过,如果样少的话换Takara的Genome walking Kit,你们头有的是钱
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7楼2012-03-21 09:32:27
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不是说第一轮 电泳不出图么？因为产物太多？
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8楼2014-03-15 16:22:57
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薰衣草871110

新虫 (初入文坛)
你酶加了多少啊？
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9楼2014-04-11 10:01:42
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爆牙B

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到过这样的问题，后来发现是DNA质量不行。建议重新提DNA .
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10楼2014-08-11 10:50:50
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zxnju0102

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhouheyi_2 at 2011-03-13 14:36:18
我也有稀释过DNA约1倍左右，跑出来也是这样的图...

我遇到和楼主一样的问题，第二轮第三轮是涂抹状条带，不知楼主后来如何解决的
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11楼2014-11-26 15:39:07
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