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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助，急！！！
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chenting100

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求助，急！！！ 已有4人参与

cDNA序列3000kb，用ExTaq和LATaq都扩gDNA都扩不出来，有什么其他的办法吗？
听说有一种Takara的酶，可以分段设计引物，把扩增每一小段拼接出来，有哪位大侠知道吗，指导一下，不胜感激啊
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1楼 2011-03-11 11:25:24
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
是RACE吧  自己查查
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与人玫瑰手有余香
2楼2011-03-11 14:46:54
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-11 20:53:46
请问你是从cDNA里面RT-PCR扩增吗？怎么会有gDNA。是的话，那你可以用拼接PCR的方法来做。简单地说就是你设计一对全长引物，然后设计一对中间引物，大概在1500bp的位置，这一对中间引物必须是反向互补的，他们分别和全长引物扩增得到两端序列，然后这两端序列之间退火，用全长引物进行拼接PCR，就会得到你的基因了。特别提到的是酶必须用不加A尾的pfu酶，TAKARA的primer star就可以了，片段GC含量高的话，用相应的GC Buffer。好运。
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3楼2011-03-11 14:59:34
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★
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看天(金币+1): 鼓励交流 2011-03-14 12:31:35
还有就是RNA提取质量一定要好，反转录不能出现失误，反转录后尽量直接PCR，避免过夜。还要注意，最好跑一个cDNA的图片，确认其覆盖到了3000bp，且比较均匀。
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4楼2011-03-11 15:01:46
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chenting100

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-03-11 14:59:34:
请问你是从cDNA里面RT-PCR扩增吗？怎么会有gDNA。是的话，那你可以用拼接PCR的方法来做。简单地说就是你设计一对全长引物，然后设计一对中间引物，大概在1500bp的位置，这一对中间引物必须是反向互补的，他们分别 ...

你好，感谢你的回复。我是拿到了cDNA全长，3000kb，设计全长引物拿gDNA全长，可能是gDNA全长太长，无扩增。现在想分段设计引物，扩增gDNA，然后拼接出来。
    听说有种TAKALA酶可以在扩增时直接拼接，不知道是什么酶？
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5楼2011-03-14 11:27:19
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
要看你的目的是什么
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6楼2011-03-14 11:54:59
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yabxxh

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by chenting100 at 2011-03-14 11:27:19:
你好，感谢你的回复。我是拿到了cDNA全长，3000kb，设计全长引物拿gDNA全长，可能是gDNA全长太长，无扩增。现在想分段设计引物，扩增gDNA，然后拼接出来。
    听说有种TAKALA酶可以在扩增时直接拼接，不知道是 ...

呵呵，恕在下孤陋寡闻，没有听说过takara有这种酶，理论上也不可能有吧，只是说takara的primerstar，产生的都是不加A的末端，你可以直接将纯化后的PCR产物拼接起来，而不会产生移码，拼接还是要自己设计拼接引物去做的，酶不可能强大到如此地步，也可能我孤陋寡闻 ，呵呵，好运
还有，刚做研究的时候不想总想着走捷径，这样对你以后的发展不好，先把基础打实，呵呵
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7楼2011-03-15 09:26:46
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