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pitty595铜虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】特异性引物的设计已有10人参与
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| 需要设计针对某一微生物的16S rRNA gene特异性的引物，要求连97%相似性的相邻细菌都不能扩增，即非常特异的引物，大家有什么好方法和建议么？我花了很长时间设计，BLAST比对后发现特异性很高，可是PCR实验时却还是很扩增相邻16S。郁闷…… |
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2楼2011-02-25 07:56:33
doubleshen
银虫 (小有名气)
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3楼2011-02-25 20:08:17
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4楼2011-02-28 22:17:12
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rainwander(金币+2): 鼓励交流！！！ 2011-04-12 19:53:02
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巢式PCR的定义： 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 巢式PCR反应： 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。 巢式PCR反应模式图： 巢式PCR的实验步骤： 第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。 第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。 由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。 巢式PCR的应用 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR。 |
5楼2011-03-23 15:53:06
6楼2011-04-12 19:24:40
7楼2011-04-12 23:30:22
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wolfebst(金币+3): 感谢交流 2011-04-14 16:42:51
rainwander(EPI+1): 2011-04-14 17:25:02
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rainwander(EPI+1): 2011-04-14 17:25:02
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想再说明一下：之前传这个文献之前我没有很仔细的阅读过，然后去打印出来的看了一遍，发现这篇文献上漏洞其实不少，而且关于引物设计问题说明的也不是很详细，已经下载看过的同志择其优就好。 错误的地方：综述部分的第七行 rRNA 是细菌和真核细胞核糖体的基本组成部分, 编码rRNA 的基因是按5′- 16S- 23S- 5S-3′方式排列的, 由两个非编码的间隔区序列所分开。 前面一句会让人产生误解，“编码rRNA 的基因是按5′- 16S- 23S- 5S-3′方式排列的, 由两个非编码的间隔区序列所分开。”指的是细菌的。行内人应该会知道，但是会误导初学者或行外人。 有哪位虫友有关于引物设计的比较好的文献也分享下，真的得恶补这方面的知识。 |
8楼2011-04-14 12:05:30
9楼2012-05-10 22:07:39
10楼2014-11-21 09:39:30
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