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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？
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未知树

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？ 已有7人参与

制备了一种多抗，但是，在进行细胞内免疫荧光实验时，非特异性非常非常的强，几乎与实验组无法区分。

制备过程：
1，克隆目的基因至表达载体pMal-C4x。
2，表达纯化目的蛋白。X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）
3，纯化融合蛋白X-MBP，很纯！
4，注射新西兰大白兔。
5，收集血清。


PS： 注射大白兔之前，没有切除标签蛋白MBP（约42KDa）.
在western blot试验中， 该抗体的特异性非常好。 但是， 当用于细胞实验室时， 非特异性出奇的高， 实验组和对照组， 一模一样， 几乎看不出任何区别。

在网上查看看了一些方法， 仍然不是太明白。

如何才能有效地降低特异性。  
请各位虫友支招，万分感谢~
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每一天都是一个新的起点
1楼 2011-02-14 22:40:50
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hyanzi9920

铜虫 (初入文坛)
★
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送鲜花一朵
引用回帖:
925633楼: Originally posted by snoopyzxx at 2011-02-15 09:30:23:
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。

您好，我想请问下您用免疫原偶联来制作亲和层析介质来特异性纯化多克隆抗体，应该选择什么样填料啊，我是新手，忘不吝赐教哦，非常感谢。
PS.我想偶联的免疫原是MBP-x蛋白，能不能直接选Amylose 树脂作为偶联基质呢
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丘吉尔说，Never Never Never Give Up ！！！
12楼2012-04-19 11:12:10
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-02-15 09:29:29
可能原因：
1.多抗是否纯化？去除非特异性的其他蛋白？WB和荧光对抗体的要求是不同的。
2.细胞中是否有其他蛋白与其有交叉反应？
3.阴性对照结果如何，即用同源的抗体进行试验？
赞一下(2人) 回复此楼
52187644
2楼2011-02-15 09:03:12
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): good 2011-02-15 14:11:36
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。
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hyanzi9920
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
3楼2011-02-15 09:30:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-02-15 14:11:52
免疫荧光对抗体要求很高，都是用单克隆抗体做的吧
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-02-15 14:05:21
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