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【求助/交流】100金求助MTT法测试药物细胞毒性及共聚焦显微镜使用的问题
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我们合成了一种大分子药物载体，查了一些文献，想通过MTT法测试大分子载体本身的细胞毒性，但我们实验室是做合成的，并没有任何细胞培养的经验，所以只好根据文献照猫画虎写了下面的实验步骤： 步骤1 接种：将海拉细胞按每孔6×104个细胞的密度接种于96孔培养板，在细胞培养基中培养24h(39℃、pH=6.8、5%CO2)。 步骤2 药物培养基培养：移除之前的培养基，实验组加入含有未载药的大分子载体的细胞培养基，对照组加入不含大分子载体的细胞培养基，在39℃下培养24小时。 步骤3 继续培养：而后将两组的培养基替换为新的细胞培养基，分别在39℃下培养24小时。 步骤4 MTT法测定：加入一定量的MTT液，继续培养4h，然后吸除培养基，用PBS溶液清洗三次，再在每孔中加入一定量的DMSO并震荡10min，在酶标仪上测定对照组及实验组各孔在490nm波长处的吸收值。 所以我想问的问题都很初级： 1.上面的实验步骤有什么问题吗？（包括实验步骤和措辞用句） 2.在步骤3中，培养多长时间合适呢？如果时间过长，没有被药物杀死的细胞的继续增殖会对实验结果造成影响吗？ 3.检测细胞的毒性有没有什么通用的标准？ 4.大分子载体是有温敏性和pH敏感性的，所以在不同的温度下药物的释放速率会非常不同。我们想尽量了解大分子在肿瘤组织和细胞中的药物释放情况，所以想知道步骤中选择的温度和pH是否合理？ 下面两个问题是关于共聚焦显微镜的，因为我们还想通过共聚焦显微镜对大分子的毒性进行表征。 5.使用共聚焦显微镜是不是必须用大分子包载荧光探针？如果大分子不能包载荧光探针，是不是就无法通过共聚焦显微镜进行表征了呢？感谢虫友，这个问题已经解决 6.一般来说，共聚焦显微境是如何辨别死细胞和活细胞的？感谢虫友，这个问题已经解决 7.我们想知道大分子被内吞后在细胞内的分布情况，使用共聚焦显微镜能达到这个目的吗？如何做呢？感谢虫友，这个问题已经解决 只要诸位虫友即使对上面的一个问题比较清楚，也请帮忙解答。先在这里谢过！ 我的QQ：676727023，欢迎内行加我交流，问题解答完满后再追加100金币。 [ Last edited by paralife on 2011-1-11 at 11:20 ] |
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paralife(金币+5): 2011-01-11 10:00:16
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楼主，做实验前要多做些准备工作，多查阅些文献资料，MTT这种经典的实验Protocol网上一搜一大把，你连细胞培养温度是37度（而不是39度）都能搞错，ORZ。 给你一份ATCC 的MTT Assay Protocol http://d.namipan.com/d/c898318cc ... 3986a13054158040100 |
16楼2011-01-11 09:55:06
