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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】100金求助MTT法测试药物细胞毒性及共聚焦显微镜使用的问题
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 paralife 的 29 个金币

paralife

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】100金求助MTT法测试药物细胞毒性及共聚焦显微镜使用的问题

我们合成了一种大分子药物载体，查了一些文献，想通过MTT法测试大分子载体本身的细胞毒性，但我们实验室是做合成的，并没有任何细胞培养的经验，所以只好根据文献照猫画虎写了下面的实验步骤：

步骤1 接种：将海拉细胞按每孔6×104个细胞的密度接种于96孔培养板，在细胞培养基中培养24h(39℃、pH=6.8、5%CO2)。
步骤2 药物培养基培养：移除之前的培养基，实验组加入含有未载药的大分子载体的细胞培养基，对照组加入不含大分子载体的细胞培养基，在39℃下培养24小时。
步骤3 继续培养：而后将两组的培养基替换为新的细胞培养基，分别在39℃下培养24小时。
步骤4 MTT法测定：加入一定量的MTT液，继续培养4h，然后吸除培养基，用PBS溶液清洗三次，再在每孔中加入一定量的DMSO并震荡10min，在酶标仪上测定对照组及实验组各孔在490nm波长处的吸收值。

所以我想问的问题都很初级：
1.上面的实验步骤有什么问题吗？（包括实验步骤和措辞用句）
2.在步骤3中，培养多长时间合适呢？如果时间过长，没有被药物杀死的细胞的继续增殖会对实验结果造成影响吗？
3.检测细胞的毒性有没有什么通用的标准？
4.大分子载体是有温敏性和pH敏感性的，所以在不同的温度下药物的释放速率会非常不同。我们想尽量了解大分子在肿瘤组织和细胞中的药物释放情况，所以想知道步骤中选择的温度和pH是否合理？

下面两个问题是关于共聚焦显微镜的，因为我们还想通过共聚焦显微镜对大分子的毒性进行表征。
5.使用共聚焦显微镜是不是必须用大分子包载荧光探针？如果大分子不能包载荧光探针，是不是就无法通过共聚焦显微镜进行表征了呢？感谢虫友，这个问题已经解决
6.一般来说，共聚焦显微境是如何辨别死细胞和活细胞的？感谢虫友，这个问题已经解决
7.我们想知道大分子被内吞后在细胞内的分布情况，使用共聚焦显微镜能达到这个目的吗？如何做呢？感谢虫友，这个问题已经解决

只要诸位虫友即使对上面的一个问题比较清楚，也请帮忙解答。先在这里谢过！
我的QQ：676727023，欢迎内行加我交流，问题解答完满后再追加100金币。

[ Last edited by paralife on 2011-1-11 at 11:20 ]
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1楼2011-01-10 22:13:04
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travelerchem

至尊木虫 (知名作家)
★ ★
paralife(金币+1):5 2011-01-10 22:32:43
paralife(金币+4):不好意思，刚刚金币给错了。回答完后面的提问继续给分哈。 2011-01-10 22:34:15
dhd997(金币+2):good 2011-01-11 09:41:37
5.如果大分子本身带有荧光基团，则不需要包载荧光探针。
6.利用细胞双染，采取红绿两种染料，一般红色如PI染料针对死细胞，绿色Calcein-AM针对活细胞。
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2楼2011-01-10 22:23:35
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paralife

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by travelerchem at 2011-01-10 22:23:35:
5.如果大分子本身带有荧光基团，则不需要包载荧光探针。
6.利用细胞双染，采取红绿两种染料，一般红色如PI染料针对死细胞，绿色Calcein-AM针对活细胞。

5.也就是说如果大分子本身没有荧光基团，则必须让它载上荧光探针才可以吗？
6.对细胞进行染色是如何进行的呢？需要大分子对染料进行包载吗？
谢谢。
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3楼2011-01-10 22:32:29
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flip-flap

金虫 (小有名气)
★ ★
paralife(金币+3):我们这个大分子载体对药物是缓释的，所以我们想通过不同时间细胞的死亡率来考察药物在细胞内的释放情况，不知道这样的话每小时取一组样合适不？ 2011-01-10 23:24:48
paralife(金币+2):补两个。 2011-01-10 23:29:19
dhd997(金币+2):鼓励交流 2011-01-11 09:41:54
2、培养板上的孔可以分成若干组，设置不同的药物浓度和空白对照，加药、加MTT、测吸光值等所有操作按顺序一气做完就可以呀，为什么要每隔一小时从一个孔里取一次样呢？
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5楼2011-01-10 22:40:11
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flyingmomo

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):鼓励交流，感谢分享经验~~ 2011-01-10 23:02:39
paralife(金币+3):这里测试的波长是甲瓒的吗？那么甲瓒是有570这个峰？ 2011-01-10 23:28:04
paralife(金币+2):给少了，等你回答完了继续给哈。 2011-01-10 23:29:03
“加入一定量的MTT液，继续培养4h，然后吸除培养基，用PBS溶液清洗三次，再在每孔中加入一定量的DMSO并震荡10min，在酶标仪上测定对照组及实验组各孔在490nm波长处的吸收值。”
前面养的细胞不同，但后面的步骤应该是大体相同的，我们实验中加入MTT后加PBS洗会影响甲瓒的析出数量，需要再斟酌下~
还有波长我们都是570nm~
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6楼2011-01-10 22:54:53
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travelerchem

至尊木虫 (知名作家)
paralife(金币+3):嗯，清楚了。谢谢。 2011-01-10 23:28:30
paralife(金币+2): 2011-01-10 23:28:35
5.也就是说如果大分子本身没有荧光基团，则必须让它载上荧光探针才可以吗？
6.对细胞进行染色是如何进行的呢？需要大分子对染料进行包载吗？
谢谢。 [/quote]

5.是的，否则无法在显微镜下观测。
6.对于细胞染色，直接配置以上燃料的水溶液即可。染料针对的细胞本身，不需要让大分子包载。
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7楼2011-01-10 23:02:04
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liujizgd

木虫 (著名写手)
顺道学习了，马上也要做这个了
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8楼2011-01-11 04:20:33
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aifei1206

铁杆木虫 (著名写手)
★
paralife(金币+2):谢谢讨论。这个大分子是设计为肿瘤细胞靶向的，所以我们想了解的就是大分子对肿瘤细胞的毒性。而后再通过MTT考察载药后的大分子进行药物释放。不知道这样的设计是否合理？ 2011-01-11 09:00:29
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-11 09:42:17
顺道问一个问题，用海拉细胞做药物载体的细胞毒性评估合理吗？大家都这么做吗？不是应该用正常组织细胞来做吗？
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9楼2011-01-11 08:31:19
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hanrch

木虫 (小有名气)
★ ★
paralife(金币+5):谢谢，请看回复贴。 2011-01-11 09:04:17
dhd997(金币+2):鼓励交流 2011-01-11 09:42:33
HeLa细胞做细胞毒性可以，但是条件允许的话最好多做几种细胞，当然用正常的细胞就更好了。肿瘤细胞的非特异性内吞比较强，可能会对结果有影响，但是比较好培养，所以，一般可以采用。另外，MTT本身是一种比较“粗”的方法，只能判定细胞增殖是否正常，至于细胞的功能是否受影响就不知道了。
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11楼2011-01-11 08:58:11
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paralife

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hanrch at 2011-01-11 08:58:11:
HeLa细胞做细胞毒性可以，但是条件允许的话最好多做几种细胞，当然用正常的细胞就更好了。肿瘤细胞的非特异性内吞比较强，可能会对结果有影响，但是比较好培养，所以，一般可以采用。另外，MTT本身是一种比较“粗 ...

谢谢。这个大分子是设计为肿瘤细胞靶向的，所以我们想了解的是大分子肿瘤细胞对这个分子的内托以及大分子对肿瘤细胞的毒性。所以选择了海拉细胞。但这个分子是利用叶酸识别肿瘤细胞的，不知道Hela系细胞是否过表达叶酸受体呢？
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12楼2011-01-11 09:04:29
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sunjump

至尊木虫 (知名作家)
★ ★
dhd997(金币+2):有道理 2011-01-11 09:42:47
paralife(金币+3): 2011-01-11 09:45:35
细胞培养是个比较专业的实验，
特别是合成大分子的生物毒性实验更是如此，
相关规范应该参照药物的规定，
建议最好是请专业的实验室协助进行实验
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13楼2011-01-11 09:14:50
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paralife

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sunjump at 2011-01-11 09:14:50:
细胞培养是个比较专业的实验，
特别是合成大分子的生物毒性实验更是如此，
相关规范应该参照药物的规定，
建议最好是请专业的实验室协助进行实验

谢谢你的建议。但我们现在要写一个基金申请，想把这个实验步骤写的严谨一些。能帮忙挑挑刺吗？
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15楼2011-01-11 09:45:42
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超越轮回

木虫 (正式写手)
paralife(金币+5): 2011-01-11 10:00:16
楼主，做实验前要多做些准备工作，多查阅些文献资料，MTT这种经典的实验Protocol网上一搜一大把，你连细胞培养温度是37度（而不是39度）都能搞错，ORZ。
给你一份ATCC 的MTT Assay Protocol
http://d.namipan.com/d/c898318cc ... 3986a13054158040100
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16楼2011-01-11 09:55:06
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paralife

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 超越轮回 at 2011-01-11 09:55:06:
楼主，做实验前要多做些准备工作，多查阅些文献资料，MTT这种经典的实验Protocol网上一搜一大把，你连细胞培养温度是37度（而不是39度）都能搞错，ORZ。
给你一份ATCC 的MTT Assay Protocol
[url]http://d.nami ...

感谢帮助，大分子载体是有温敏性和pH敏感性的，所以在不同的温度下药物的释放速率会非常不同。我们想尽量了解大分子在肿瘤组织和细胞中的药物释放情况，所以想知道步骤中选择的温度和pH是否合理？
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17楼2011-01-11 10:00:52
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custardchen

金虫 (小有名气)
paralife(金币+5):非常感谢。 2011-01-11 10:15:46
可以用叶酸来识别HeLa 细胞   文献上有很多啊
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19楼2011-01-11 10:10:49
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catherine_

木虫 (正式写手)
paralife(金币+5):非常感谢。 2011-01-11 10:49:41
同学。。。mtt的具体实验条件是需要摸条件的，你当条件优化只是说说而已么。。。

你如果认为哪些实验条件可能对实验结果造成影响，就应该做梯度实验测试啊。。。。。没有哪一个实验设计的时候能完全满足条件，都是一边做，一边优化，最终获得有意义的结果。

mtt的方法是普遍的，可是要适应自己实验室的课题，具体实验还得自己做，你问大家试验温度和ph的预设是否合理，倒不如自己把该试的温度和ph都做一遍。这么问没有任何意义。
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20楼2011-01-11 10:35:44
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paralife

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by catherine_ at 2011-01-11 10:35:44:
同学。。。mtt的具体实验条件是需要摸条件的，你当条件优化只是说说而已么。。。

你如果认为哪些实验条件可能对实验结果造成影响，就应该做梯度实验测试啊。。。。。没有哪一个实验设计的时候能完全满足条件， ...

非常感谢你的回答，MTT的条件确实需要摸索，但我们最近要申请基金，需要把这个试验步骤写进去的，所以我想让这个实验步骤看起来严谨一些，非常想知道你有什么建议呢？
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21楼2011-01-11 10:51:10
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robin79196421

金虫 (小有名气)

关于问题7

paralife(金币+8):非常感谢！ 2011-01-11 11:18:40
7.我们想知道大分子被内吞后在细胞内的分布情况，使用共聚焦显微镜能达到这个目的吗？如何做呢？

这个你可以在你的载体里包裹荧光分子。比如罗丹明，Nile Red，cy-5。这个对于你们应该不成问题，就把荧光分子当着药包裹就行了，我们实验室就这么做的。
这样你可以通过荧光共聚焦显微镜看到你的载体在细胞内的分布情况。
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22楼2011-01-11 10:59:11
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
paralife(金币+10):说的很详细，非常感谢！ 2011-01-11 11:19:19
如果观察大分子的药物毒性，最好用正常细胞株进行检测，比如说HELF(人胚肺成纤维细胞),如有条件，也可以用正常细胞株和肿瘤细胞株进行对照处理，结果更有说服性。进行培养时，起初的细胞数量一般不要太少，不然细胞生长不好，可考虑8000-10000个/孔，需要在实验中摸索，实验中需要设置阴性对照，并可将大分子分别稀释成不同的浓度进行测试，这个也是需要做预实验的，96孔板培养细胞测试时，每个浓度要设置复孔（一般三孔即可），进行平行实验，测试样品对细胞生长的影响结果出来以后，有一个标准去评价样品的安全性的，可以从网上找到的，祝实验顺利！
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23楼2011-01-11 11:08:15
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liang1007

金虫 (小有名气)
paralife(金币+3): 2011-01-14 16:32:31
培养温度为什么不是37°啊，不是文献上都用37吗？
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24楼2011-01-11 11:24:51
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flyingmomo

新虫 (小有名气)
paralife(金币+5):谢谢 2011-01-11 22:58:50
引用回帖:
Originally posted by flyingmomo at 2011-01-10 22:54:53:
“加入一定量的MTT液，继续培养4h，然后吸除培养基，用PBS溶液清洗三次，再在每孔中加入一定量的DMSO并震荡10min，在酶标仪上测定对照组及实验组各孔在490nm波长处的吸收值。”
前面养的细胞不同，但后面的步骤应 ...

我所查与我课题相关现有文献资料中做MTT的大多是570nm，当然网上查到有490nm的，曾经做过对比，与570比，490nm值小好多~
理论依据没查啦~lz可继续完善~
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25楼2011-01-11 15:49:10
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2虾米

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-18 23:56:38
如果你要测这个药物毒性的话,MTT,不能说明很多问题.只是很基础的一个.这个是测的细胞活性抑制率.凋亡有很多指标可以测
至于你的MTT步骤,看你用的是什么试剂盒,试剂盒上面步骤都有.按着说明书,再注意一些细节基本没有问题.至于药物作用的浓度和时间,你可以先做一个预实验,摸索一下.
另外,不知道你的药物有没有颜色,如果有颜色的话,会对结果有很大影响.
祝你好运!
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26楼2011-05-18 20:06:57
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2虾米

铜虫 (小有名气)
对于你说的实验具体步骤,可以直接在网上下一个MTT试剂盒说明书做参考.
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27楼2011-05-18 20:08:28
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邱慧林立

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
顺道学习了，马上也要做这个了
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29楼2012-03-20 11:01:40
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食品科学2012

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得这个步骤有点小的瑕疵！
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30楼2012-11-26 13:14:16
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简单回复
zx20124楼
2011-01-10 22:35   回复  
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xuxiaoxu31楼
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