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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNA退火
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】DNA退火 已有7人参与

大家谁做过单链DNA片段退火，形成双链的实验呢？还有DNA的磷酸化，都需要注意哪些问题？
我做了很多歌DN片段的退火和磷酸化，在确定载体没有问题的情况下，都不能与退火形成的DNA双链连接，哪个细节出错了呢。。。

我是先进行DNA退火，然后再将退火后的双链DNA进行磷酸化，具体步骤如下：
退火体系： 100pmol/uL的互补DNA单链各自加入10uL，再加入去离子水80uL，组成了100uL的体系，混匀，在PCR仪中退火，退火步骤如下：95摄氏度3min；每8s降低0.1摄氏度，降至25摄氏度，然后4摄氏度长期保存。

退火后的双链DNA进行磷酸化，用的是NEB公司的T4 多聚核苷酸激酶，是50uL体系：加入激酶Buffer 5 uL， DNA 15uL， T4多聚核苷酸激酶1 uL，ddH2O 29uL， 于37℃ 温育30min， 然后65℃ 20min 热失活。

以上是我的具体实验步骤，谢谢！

[ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:27 ]
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1楼 2011-01-09 22:15:38
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silicare

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我是水中直接退火复兴，梯度降温和直接冰浴都试过，效果差不多

退火之后也没有磷酸化之类的处理

又一个问题就是你的感受态是不是够给力

感受态效率低是很多实验失败的主要因素，尤其是连接产物
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9楼2011-01-10 11:46:29
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silicare

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 13:03:29:


恩，谢谢美女，呵呵~我用的是电转化，有两个片段可以连接上，其余的都不能连接，我用空载体转化，效率还不错。。

什么叫还不错，几次方？ 连接片段和空载体是两码事
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11楼2011-01-10 13:15:01
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:17:46:



我用的感受态细胞是DH5a，空载体转化，100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板，没有计数，大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板，长出阳性克隆是50个左右，阴性对照没有长出菌 ...

你还是 没有明白转化效率的重要性

空载体做转化没有不长的
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13楼2011-01-10 14:22:52
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:24:25:


哦，那我该怎样测量感受态细胞的转化效率呢？

网上到处都是，百度一下就可以

一般就是转化0.1ng 看看100ul感受态能够长出多少个菌斑，换算成1ug的菌斑数就是转化效率
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15楼2011-01-10 14:30:09
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silicare

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:37:51:


哦，好，请问在转化过程中还需要注意哪些事项呢？

低温，轻柔，快速，无菌，一个高效感受态是前提，做连接产物（尤其你这还是退火的）至少也要6次方以上的效率，7次方最佳，8次方必成功

6次方以下就扔了吧
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17楼2011-01-10 14:43:01
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silicare

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:46:48:

恩，好，真是太感谢你了~请问你用的感受态细胞也都是自己制作的吗？

分子克隆的就很好
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19楼2011-01-10 14:49:04
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