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yshwasd

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】想做半定量RT-PCR,想到几个问题，急求解！忘高手赐教！！

本人想做一批大鼠各组织JNK蛋白的半定量RT-PCR，但是组织保存在-80度里时间已数月，未提RNA，不知还能用不？！
做半定量RT费时不？！基本费用如何？!有哪些需提前注意的问题。。。
期待各位，特别是做过RT大侠们给些指点！！
不胜感激呐!!!
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1楼 2011-01-03 22:14:58
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3):谢谢分享。 2011-01-04 06:16:54
组织-80问题应该不大，提取RNA后检测看看质量吧
做半定量RT应该不是很贵，提取RNA，合成cDNA，然后跑PCR和电泳就行了，鉴于你是新手，建议你买RNA提取盒子（几百元）和cDNA第一链合成盒子（大概100多），价格我知道的不是很准确，PCR就买Taq酶就是了，电泳买点琼脂糖等药品，很便宜，合成引物一对不超过100元，再就是点耗材，没多少钱，我上面说的都是最小样本量，花多少钱还得看你做多少样本
新手需要注意的就是尽量都买盒子做，不要在研究技术上浪费太多时间，另外就是好好设计引物，时间紧钱宽裕呢就多设计两对，争取一次成功
另外，提醒楼主，半定量RT根本没准，好好研究你的实验目的，如果定量准确很重要，那强烈建议考虑定量PCR

[ Last edited by yujiaping1 on 2011-1-3 at 22:31 ]
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2楼2011-01-03 22:29:54
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yanliusu

新虫 (小有名气)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~~ 2011-01-04 09:42:25
组织放在-80℃可以提取RNA，如果想省钱就用Trizol提取，操作小心一些，提取的质量也不错，如果不怎么会提的话建议买试剂盒提取。提取完之后测定OD值，然后每个样品取等量的RNA反转录，然后取等体积的cDNA扩PCR。扩的时候两对引物，一对内参，一对目的基因，然后跑电泳检测就可以了。半定量一般做个参考用，费用不是很高，严格的话要做real time PCR，那个费用比较高。
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3楼2011-01-04 09:25:37
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