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yshwasd

铜虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】想做半定量RT-PCR,想到几个问题,急求解!忘高手赐教!!

本人想做一批大鼠各组织JNK蛋白的半定量RT-PCR,但是组织保存在-80度里时间已数月,未提RNA,不知还能用不?!
做半定量RT费时不?!基本费用如何?!有哪些需提前注意的问题。。。
期待各位,特别是做过RT大侠们给些指点!!
不胜感激呐!!!
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


★ ★ ★
reasonspare(金币+3):谢谢分享。 2011-01-04 06:16:54
组织-80问题应该不大,提取RNA后检测看看质量吧
做半定量RT应该不是很贵,提取RNA,合成cDNA,然后跑PCR和电泳就行了,鉴于你是新手,建议你买RNA提取盒子(几百元)和cDNA第一链合成盒子(大概100多),价格我知道的不是很准确,PCR就买Taq酶就是了,电泳买点琼脂糖等药品,很便宜,合成引物一对不超过100元,再就是点耗材,没多少钱,我上面说的都是最小样本量,花多少钱还得看你做多少样本
新手需要注意的就是尽量都买盒子做,不要在研究技术上浪费太多时间,另外就是好好设计引物,时间紧钱宽裕呢就多设计两对,争取一次成功
另外,提醒楼主,半定量RT根本没准,好好研究你的实验目的,如果定量准确很重要,那强烈建议考虑定量PCR

[ Last edited by yujiaping1 on 2011-1-3 at 22:31 ]
2楼2011-01-03 22:29:54
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yanliusu

新虫 (小有名气)


★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~~ 2011-01-04 09:42:25
组织放在-80℃可以提取RNA,如果想省钱就用Trizol提取,操作小心一些,提取的质量也不错,如果不怎么会提的话建议买试剂盒提取。提取完之后测定OD值,然后每个样品取等量的RNA反转录,然后取等体积的cDNA扩PCR。扩的时候两对引物,一对内参,一对目的基因,然后跑电泳检测就可以了。半定量一般做个参考用,费用不是很高,严格的话要做real time PCR,那个费用比较高。
3楼2011-01-04 09:25:37
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