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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】dUTP UNG/UDG法抑制污染的具体方法
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傻子

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】dUTP UNG/UDG法抑制污染的具体方法

最近实验室污染严重，简单的防止污染的方法基本没用了，看到有dUTP UNG/UDG法抑制污染，但都写的不清楚，所以有几点想请教下做过的朋友，还望赐教！谢谢！

1. 在已经出现污染的情况下，加入dUTP是否可以抑制污染，看到有说直接按比较加入dUTP就可以抑制污染，那原来存在的产物污染是不是也能被dUTP识别呢？

2. 类似问题1,在已经存在污染的条件下，使用该方法是否能完全抑制污染呢？UNG/UDG对无dUTP的链是无效的，那原来的污染是否会不再产生影响呢？
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1楼 2010-12-15 10:54:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+6): good 2011-04-22 09:10:20
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-04-21 15:40:06:
就是说把整个序列的T都换成U了。如果不行的话，那为什么用dUTP去防止污染？对后面的步骤都没影响？
还是只是在前面的步骤中加入，灭活后再用正常的PCR体系去扩？
啊，不懂啊怎么办啊！

UDG-UTP防污染的原理前面已经讲过

UTP不妨碍Taq合成“DNA” 双链，此时的DNA不是严格意义的DNA，是无法做克隆的
但是作为SYBR Green嵌入的双链是可以的
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8楼2011-04-21 23:25:36
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普通回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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傻子(金币+2):谢谢指点 2010-12-15 12:36:39
dhd997(金币+2):依旧很热心，鼓励 2010-12-15 15:38:18
这个方法的原理是使用dUTP替代dNTP，在非PCR条件下，比如在混PCR体系的时候，一些非特异扩增如果进行，就会引入dUTP。然后在正式上PCR机器的时候，第一步反应是50℃孵育，让UDG酶充分反应，去掉那些非特异扩增。然后预变性94度的时候，就把UDG酶失活了

像你说的污染，应该是实验室洁净度的问题了……解决方法很简单。台面、枪什么的擦干净，用酒精再擦一次。然后照紫外，半小时就够了。枪头高压灭菌。

还有就是你的试剂是不是污染了……污染了就换新的吧
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2楼2010-12-15 12:22:09
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
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1949stone: 可以直接pm 2011-04-21 10:07:23
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-15 12:22:09:
这个方法的原理是使用dUTP替代dNTP，在非PCR条件下，比如在混PCR体系的时候，一些非特异扩增如果进行，就会引入dUTP。然后在正式上PCR机器的时候，第一步反应是50℃孵育，让UDG酶充分反应，去掉那些非特异扩增。然 ...

我想问一下啊，我们用dUTP代替了dNTP，对后面的连接和转化有没有影响？最近我们做的克隆都是阴性，郁闷
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3楼2011-04-21 09:42:40
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 最近见你不容易 2011-04-22 09:09:55
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-04-21 09:42:40:
我想问一下啊，我们用dUTP代替了dNTP，对后面的连接和转化有没有影响？最近我们做的克隆都是阴性，郁闷

那当然是不可能做出克隆的啦
如果你做出阳性克隆那是见鬼了…………而且很猛的那种……
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4楼2011-04-21 12:12:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-21 12:12:26:
那当然是不可能做出克隆的啦
如果你做出阳性克隆那是见鬼了…………而且很猛的那种……

为什么呀？我虽然看了一下原理，但是还是弄不清楚啊，请你详细解答一下啦，万分感激啊谢谢谢谢！
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5楼2011-04-21 14:08:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by sxxuan at 2011-04-21 14:08:13:
为什么呀？我虽然看了一下原理，但是还是弄不清楚啊，请你详细解答一下啦，万分感激啊谢谢谢谢！

因为DNA要T啊，U是不行的……
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6楼2011-04-21 14:35:23
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-21 14:35:23:
因为DNA要T啊，U是不行的……

就是说把整个序列的T都换成U了。如果不行的话，那为什么用dUTP去防止污染？对后面的步骤都没影响？
还是只是在前面的步骤中加入，灭活后再用正常的PCR体系去扩？
啊，不懂啊怎么办啊！
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7楼2011-04-21 15:40:06
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-04-21 23:25:36:
UDG-UTP防污染的原理前面已经讲过

UTP不妨碍Taq合成“DNA” 双链，此时的DNA不是严格意义的DNA，是无法做克隆的
但是作为SYBR Green嵌入的双链是可以的

嗯，这次终于明白了，呵呵，谢谢你啊，实在太好了！
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9楼2011-04-22 08:58:59
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z631535213

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-15 12:22:09
这个方法的原理是使用dUTP替代dNTP，在非PCR条件下，比如在混PCR体系的时候，一些非特异扩增如果进行，就会引入dUTP。然后在正式上PCR机器的时候，第一步反应是50℃孵育，让UDG酶充分反应，去掉那些非特异扩增。然后 ...

大神，请教下。在百度知道中“UNG酶不会将目的条带降解么？”提到在做PCR时，用dUTP代替dTTP，扩增产物中所有T的位置被取代。在下次PCR前，先加入UNG孵育，以前污染的含dUTP的PCR产物都被UNG酶降解。 这段话中污染的PCR产物不是用dUTP代替dTTP而产生的吗？那不是多此一举吗。
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10楼2014-11-17 17:16:33
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z631535213

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by z631535213 at 2014-11-17 17:16:33
大神，请教下。在百度知道中“UNG酶不会将目的条带降解么？”提到在做PCR时，用dUTP代替dTTP，扩增产物中所有T的位置被取代。在下次PCR前，先加入UNG孵育，以前污染的含dUTP的PCR产物都被UNG酶降解。 这段话中污染 ...

在下次PCR前，先加入UNG孵育，以前污染的含dUTP的PCR产物都被UNG酶降解

我觉得这里的污染指的是本次实验不小心被上次实验的PCR产物污染了，加入UNG酶降解掉上次实验的PCR产物
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11楼2015-10-28 14:56:37
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