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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】粪便DNA提取的问题
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dingjunrong

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】粪便DNA提取的问题

本人要提取不同人粪便中的细菌总DNA，后面要用于定量，称取的是100mg冷冻的粪便，然后按照试剂盒步骤提取的，步骤中有一步是吸取250mL上清，做下一步的提取，因为我要做定量，是不是所有的上清我都要取，然后提取里面的DNA呀，因为做到这一步时，不是所有的样品的上清都一样多的，然后后面的步骤中所添加的提取试剂是不是要按比例增加呢？？望有经验的人指点，谢谢了！！
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1楼 2010-12-14 12:05:06
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王津

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，我也用的这个试剂盒提取的粪便DNA，但是我直接跑胶为什么没有条带，你直接跑胶有条带吗？用的多大的DNAmarker。我用的5000bp是不是太小了。
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6楼2012-09-12 14:31:06
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-14 14:33:55
dingjunrong(金币+1): 2010-12-14 17:06:57
控制一下你悬浮液的体积就可以了，
一般按照说明书要求加250ul 上清基本就够用了，剩下的可以备用。
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2楼2010-12-14 13:15:59
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dingjunrong

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-12-14 13:15:59:
控制一下你悬浮液的体积就可以了，
一般按照说明书要求加250ul 上清基本就够用了，剩下的可以备用。

可是我后面要通过PCR手段对不同粪便样品中的菌定量的，如果全部都取250ul的话，跟原来称取的粪便的重量就无法联系起来了，而且不同的样品经过多步处理离心后的上清液的体积是不同的，为了定量，是不是要取全部的比较好呀？？谢谢！
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3楼2010-12-14 16:43:33
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
dingjunrong(金币+2): 2010-12-15 08:39:50
呵呵，只要不是差数量级就可以了。PCR的定量也不是准确定量，准确率的波动范围也在10倍左右，同一DNA样本重复做也会有这个波动的。所以你取50ul和250ul所测量的结果其Ct值应该差距不大。
如果你要特别准确，可以固定粪便质量，然后把所有上清都裂解处理，然后分几次加到柱子里。
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4楼2010-12-14 20:41:52
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