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maxwell1988金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题已有5人参与
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最近在做重组基因的连接，但是连了好几次就是连不上。具体是这样的，希望高手帮忙答疑解惑下： 基因(~0.5kb)是单酶切，载体(~5kb)是双酶切，20μl体系，基因载体按摩尔比算的体积比： 基因 2μl 载体 9μl buffer 2μl PDG 2μl T4连接酶 5μl 22℃，16h。 之后就是常规的转化了，菌落PCR，单酶切鉴定后发现条带的大小不对，宣告连接失败。  要命的是做了好几次，甚至有次还做了基因载体比例的梯度连接实验，结果还是以失败告终。我想知道问题可能出在了什么地方，有什么地方可以改进的，望各位大侠们不比吝赐教！！！ |
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skkyy88888
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12楼2010-11-21 09:26:58
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+5):全面，细心 2010-11-19 10:44:48
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1、连接片段和载体的比例，不是按照ul来计算，是数量比，mol数！！！ 2、500bp的片段连接载体是不成问题的。关键在于：切出来的末端是否和载体的缺刻正好相对？ 3、不知道你的切点是平末端还是粘末端？前者是否需要脱磷处理，以提高连接效率？ 4、不知用的是哪个公司的产品，检查是否过期等。连接酶5uL？？？这是带buffer吗？如果不是，是不是浓度太高了？甘油就能够完全抑制活性了。 5、22℃连接16h是否太长了？我经常用到的是4℃，2天； 16℃，30-50min； 22℃，2-5h…… 6、建议按照说明书来做，做前仔细计算好体系，到底加多少！酶切的产物是否纯化了？纯化后溶解液是什么？是否检测浓度了？酶切后的载体是否存在自连？？ 多数以反问的形式回答楼主，希望能有帮助。 |
2楼2010-11-19 10:23:35
skkyy88888
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3楼2010-11-19 12:11:46
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4楼2010-11-19 13:22:15