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beisimai895木虫 (小有名气)
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【求助/交流】枯草芽孢杆菌感受态细胞制作方法已有1人参与
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| 想做一批枯草芽孢杆菌的感受态细胞，之后用于电转的，各位有什么好的方法吗，给我看看。 |
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实验试剂： GM：LB+0.5M山梨醇 ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油 RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇 方法： 1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5ml LB培养基中，过夜培养。 2）测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基（50ml GM）的OD在0.19-0.2之间。37℃，200rpm培养至OD600=1.0（大约3-4小时）左右。 3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。 4）用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。 5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。 6）将60μl感受态细胞中加入1-6 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过0.8kv，1.2kv），25μF，200Ω，1mm，电击1次。（持续时间4.5ms-5ms之间） 7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。 |
2楼2014-02-11 13:43:24