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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】非大肠杆菌感受态细胞的制备
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beisimai895

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】非大肠杆菌感受态细胞的制备 已有2人参与

请教一下，非大肠杆菌的感受态细胞如何制备，比如说假单胞菌或芽孢杆菌，之后打算做电转，需要详细的方法，各位有好的方法的，给我。
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1楼 2010-11-18 10:05:02
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
记得当年做BT的感受态细胞就是离心，然后洗啊洗的，洗几遍之后用了个黏糊糊的溶液给悬起来就ok了。
以下内容源自互联网，请参考。

试剂准备
1000ml三角瓶 *2    每瓶装500ml 液体LB，115度灭菌15min。
50ml离心管2个。
10%甘油超纯水配制 1L
灭菌300ul ep管50个。灭菌枪头：100ul，1000ul

大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天：
1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶（1000ml）两个以备第二天摇瓶用
3. 1L10%灭菌甘油，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

第二天：
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1升三角瓶中，接种两瓶。
5. 37°C下剧烈振荡培养2-3小时
6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次）
7. 当O.D.600值达到0.5左右时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）
8. 细胞在4°C 2500g下离心5分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）
9. 用少量的（约3-5ml）灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞。然后冰冷10%甘油稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰冷10%甘油重悬浮细胞
12. 离心，弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml ，保证细胞的最终浓度为:稀释100倍后OD600=1.
16. 将细胞按50μl等份装入微量离心管，于-80°C保存

转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-3μl DNA，质粒1ul，连接产物2-3ul ，冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中
4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞30分钟至45min以复原 （如果做质粒转化此步骤可以省略）
8. 转移细胞至适当的固体选择培养基上培养
农杆菌和大肠杆菌类似
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金币是赌出来的
2楼2010-11-18 14:05:26
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日光海

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
《Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions》你看看这个文献，铜绿假单胞菌的电击转化。不过我按照这个文献的方法做另一个假单胞菌，没做出来，可能不同的假单胞菌电击条件不一样，感受态制备主要是用去离子水和甘油洗干净，加入的外援DNA最好湿用去离子水溶解的，不要用试剂盒中的buffer溶。《3 种假单胞菌CaCl2法感受态细胞制备及转化条件》这个文献是热激转化感受态制备的，我试过了，可以将外源质粒导入进我分离的一个野生假单胞菌。不过效率比较低，复苏后将1ml菌液离心浓缩成100μL全部涂板，才长出三个菌落，但都是阳性。个人觉得还是电击转化效率高，而且电击感受态制备很简单。
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周老湿
3楼2015-06-26 15:54:14
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