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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接体系优化办法已有8人参与

我用pTXB1连接一个1194bp的片段,连了很多次,但是一直连不上,体系是
pTXB1  8 ul  目的片断 4 ul  水  5 ul  10*buffer 2 ul  T4 DNA 连接酶 1
请教大家了,急.............
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)

silicare:体积比不是摩尔比 2010-10-15 11:52:40
薄荷zwz(金币+1): 2010-10-15 13:16:19
你的连接比例载体:基因是2:1,这个比例不知道你是怎么确定的。一般连接不成功或效果不好和连接比例没控制好有很大关系,所以你要根据酶切回收后的载体基因的浓度确定最佳连接比例。
2楼2010-10-15 10:42:18
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kissing

新虫 (初入文坛)

连接

把酶切后的目的基因和载体跑胶,用Gis软件分析,精确二者的用量
3楼2010-10-15 10:43:24
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星

做链接载体与目的片段要严格定量,否则连接效率非常低!
海阔凭鱼跃,天高任鸟飞!
4楼2010-10-15 12:56:09
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

补充

我怎么样才能定量呢?那个gis软件是什么,我没用过‘
5楼2010-10-15 13:18:40
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feiye2214

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-10-15 17:05:19
个人建议:能不能做个正交试验,摸下实验条件,效率低只要转化好了,也行的吧
6楼2010-10-15 13:29:05
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

回复

什么叫做正交实验,不懂,请教,呵呵
7楼2010-10-15 16:54:03
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feiye2214

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 薄荷zwz at 2010-10-15 16:54:03:
什么叫做正交实验,不懂,请教,呵呵


这是我做的一个小正交试验,你可以把横向换成DNA比例(是mol比例,不是体积比)梯度n,纵向换成体系稀释倍数梯度(或者你想探寻的因素的梯度)m,那么你要做n×m个实验!看看那个效果好!
明白了?
8楼2010-10-16 09:03:18
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taigongzaici

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励下~ 2010-10-16 09:52:47
关于连接的问题,我是这样觉得的。
很多人说是什么连接体系啦,连接浓度,甚至摩尔比之类的。
关于正交试验,那也太麻烦了,我个人觉得没啥必要,呵呵。
因为连接是个简单而又复杂的过程,很多不可知因素的,相同的连接体系,相同的人去操作,都会出现不同的结果,
所以,我建议你多做,我的经验是你可以在转化的时候分别取不同体积的菌液铺好几个板,这样会好一些,
以上观点仅供参考
9楼2010-10-16 09:11:54
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢参与~ 2010-10-16 09:52:58
用好的DNA ligase,体系从来不变不优化,照做~~次次成功
连接比3~10:1这么宽的范围都无所谓
爱16度连30分钟或者4度过夜都行,看你连什么片段

话说,我用的是日系的TOYOBO,算是比较中档的酶了
当然另外个国产日系的酶就算了,我已经见过无数用那个做出来砸掉的……
10楼2010-10-16 09:22:46
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