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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接体系优化办法
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接体系优化办法 已有8人参与

我用pTXB1连接一个1194bp的片段，连了很多次，但是一直连不上，体系是
pTXB1  8 ul  目的片断 4 ul  水  5 ul  10*buffer 2 ul  T4 DNA 连接酶 1
请教大家了，急.............
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1楼 2010-10-15 10:35:47
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
silicare:体积比不是摩尔比 2010-10-15 11:52:40
薄荷zwz(金币+1): 2010-10-15 13:16:19
你的连接比例载体：基因是2：1，这个比例不知道你是怎么确定的。一般连接不成功或效果不好和连接比例没控制好有很大关系，所以你要根据酶切回收后的载体基因的浓度确定最佳连接比例。
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2楼2010-10-15 10:42:18
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kissing

新虫 (初入文坛)

连接

把酶切后的目的基因和载体跑胶，用Gis软件分析，精确二者的用量
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3楼2010-10-15 10:43:24
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星
做链接载体与目的片段要严格定量，否则连接效率非常低！
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海阔凭鱼跃，天高任鸟飞！
4楼2010-10-15 12:56:09
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

补充

我怎么样才能定量呢？那个gis软件是什么，我没用过‘
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5楼2010-10-15 13:18:40
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-10-15 17:05:19
个人建议：能不能做个正交试验，摸下实验条件，效率低只要转化好了，也行的吧
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6楼2010-10-15 13:29:05
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

回复

什么叫做正交实验，不懂，请教，呵呵
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7楼2010-10-15 16:54:03
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 薄荷zwz at 2010-10-15 16:54:03:
什么叫做正交实验，不懂，请教，呵呵


这是我做的一个小正交试验，你可以把横向换成DNA比例（是mol比例，不是体积比）梯度n，纵向换成体系稀释倍数梯度（或者你想探寻的因素的梯度）m，那么你要做n×m个实验！看看那个效果好！
明白了？
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8楼2010-10-16 09:03:18
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励下~ 2010-10-16 09:52:47
关于连接的问题，我是这样觉得的。
很多人说是什么连接体系啦，连接浓度，甚至摩尔比之类的。
关于正交试验，那也太麻烦了，我个人觉得没啥必要，呵呵。
因为连接是个简单而又复杂的过程，很多不可知因素的，相同的连接体系，相同的人去操作，都会出现不同的结果，
所以，我建议你多做，我的经验是你可以在转化的时候分别取不同体积的菌液铺好几个板，这样会好一些，
以上观点仅供参考
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9楼2010-10-16 09:11:54
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):感谢参与~ 2010-10-16 09:52:58
用好的DNA ligase，体系从来不变不优化，照做~~次次成功
连接比3~10:1这么宽的范围都无所谓
爱16度连30分钟或者4度过夜都行，看你连什么片段

话说，我用的是日系的TOYOBO，算是比较中档的酶了
当然另外个国产日系的酶就算了，我已经见过无数用那个做出来砸掉的……
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10楼2010-10-16 09:22:46
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