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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】流式 细胞数量问题
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】流式 细胞数量问题 已有2人参与

今天第一次做流式，是拿到其它分院实验室做的
三管情况是这样的：

第一管，实验组细胞（长期药物处理的细胞），未加抗体（这是某个老师让做的，防止细胞自发荧光）
第二管，对照组（未处理的细胞），加荧光标记的抗体
第三管，实验组（长期药物处理的细胞），加荧光标记的抗体

目的是检测第二管和第三管细胞两者表面蛋白的表达差异。

问题是这样：第三管细胞数量偏少，10分钟时间还没有统计到1000个细胞，人家就不让做了。说是必须到1万个细胞，我提出统计一下荧光值，拿第三组1000细胞和二组10000个细胞比较一下，如果三大于二，一样可以反应问题，可人家说没有统计学意义，让重新做。

其实我离心时就发现第三管细胞数量少于第二管，计数有误差，但主要问题还是离心把细胞丢失的，因为第一管没有离心，细胞数量是没有问题的。

明天再做我该注意什么呢？细胞数量再增加是对的吧，荧光抗体量也多加一点。
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1楼 2010-10-11 11:02:13
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-11 11:47:19:
一般不会因为离心丢失细胞的，600~800g离5min就足够了，如果是那种国产的15ml离心机，什么飞鸽牌的，大概就是1000~1500rpm 5min
如果发现细胞太少，那就用60mm皿养着，一般都有5次方个细胞了
1000个细胞确实太少 ...

谢谢三哥前来！
我养的细胞好多的，就是经过计数、离心洗涤、吹打，就丢失了，关键是丢失了我也不知道。
看来还是我操作细节没有把握好，下次做时多加细胞多加抗体试试了。

如果用EP管离心会不会好一些呢，15ml离心管大了些，向200微升CELL悬液中加10微升的抗体时，枪头都伸不到细胞悬液液面（离心管太长，移液枪太大）。
小离心机半径大约是15ml离心机半径的一半，转速也要提高些吧？
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3楼2010-10-11 16:33:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流。 2010-10-11 12:10:03
蜗牛VS蜗牛(金币+10): 2010-10-11 16:33:25
一般不会因为离心丢失细胞的，600~800g离5min就足够了，如果是那种国产的15ml离心机，什么飞鸽牌的，大概就是1000~1500rpm 5min
如果发现细胞太少，那就用60mm皿养着，一般都有5次方个细胞了
1000个细胞确实太少，人家不让做是正确的
荧光抗体一般都是根据细胞数加的
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2楼2010-10-11 11:47:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-10-11 19:52:16
你看着细胞沉淀不会越来越少就好了
200ul的话，当然用EP管好，15ml很大误差
我习惯用离心力（g）来表示，因为这比转速更加准确……我的建议就是600~800g 5min
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4楼2010-10-11 17:20:45
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-11 17:20:45:
你看着细胞沉淀不会越来越少就好了
200ul的话，当然用EP管好，15ml很大误差
我习惯用离心力（g）来表示，因为这比转速更加准确……我的建议就是600~800g 5min

这次用EP管离心，细胞数量没有问题了。谢谢，呵呵。
普通的离心机基本上没有自动g与RPM转换的，飞鸽牌的（15毫升离心管用）我按照半径10cm（转速1000），离心1.5毫升EP管的离心机我按半径2cm计算离心力的（转速2230），从而得出要设置的转速2230。这对不对？公式按照高中物理公式计算的F=MRW2
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5楼2010-10-13 13:55:33
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