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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】流式 细胞数量问题 已有2人参与

今天第一次做流式,是拿到其它分院实验室做的
三管情况是这样的:

第一管,实验组细胞(长期药物处理的细胞),未加抗体(这是某个老师让做的,防止细胞自发荧光)
第二管,对照组(未处理的细胞),加荧光标记的抗体
第三管,实验组(长期药物处理的细胞),加荧光标记的抗体

目的是检测第二管和第三管细胞两者表面蛋白的表达差异。

问题是这样:第三管细胞数量偏少,10分钟时间还没有统计到1000个细胞,人家就不让做了。说是必须到1万个细胞,我提出统计一下荧光值,拿第三组1000细胞和二组10000个细胞比较一下,如果三大于二,一样可以反应问题,可人家说没有统计学意义,让重新做。

其实我离心时就发现第三管细胞数量少于第二管,计数有误差,但主要问题还是离心把细胞丢失的,因为第一管没有离心,细胞数量是没有问题的。

明天再做我该注意什么呢?细胞数量再增加是对的吧,荧光抗体量也多加一点。
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-11 11:47:19:
一般不会因为离心丢失细胞的,600~800g离5min就足够了,如果是那种国产的15ml离心机,什么飞鸽牌的,大概就是1000~1500rpm 5min
如果发现细胞太少,那就用60mm皿养着,一般都有5次方个细胞了
1000个细胞确实太少 ...

谢谢三哥前来!
我养的细胞好多的,就是经过计数、离心洗涤、吹打,就丢失了,关键是丢失了我也不知道。
看来还是我操作细节没有把握好,下次做时多加细胞多加抗体试试了。

如果用EP管离心会不会好一些呢,15ml离心管大了些,向200微升CELL悬液中加10微升的抗体时,枪头都伸不到细胞悬液液面(离心管太长,移液枪太大)。
小离心机半径大约是15ml离心机半径的一半,转速也要提高些吧?
3楼2010-10-11 16:33:13
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查看全部 7 个回答

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流。 2010-10-11 12:10:03
蜗牛VS蜗牛(金币+10): 2010-10-11 16:33:25
一般不会因为离心丢失细胞的,600~800g离5min就足够了,如果是那种国产的15ml离心机,什么飞鸽牌的,大概就是1000~1500rpm 5min
如果发现细胞太少,那就用60mm皿养着,一般都有5次方个细胞了
1000个细胞确实太少,人家不让做是正确的
荧光抗体一般都是根据细胞数加的
2楼2010-10-11 11:47:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-10-11 19:52:16
你看着细胞沉淀不会越来越少就好了
200ul的话,当然用EP管好,15ml很大误差
我习惯用离心力(g)来表示,因为这比转速更加准确……我的建议就是600~800g 5min
4楼2010-10-11 17:20:45
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蜗牛VS蜗牛

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引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-10-11 17:20:45:
你看着细胞沉淀不会越来越少就好了
200ul的话,当然用EP管好,15ml很大误差
我习惯用离心力(g)来表示,因为这比转速更加准确……我的建议就是600~800g 5min

这次用EP管离心,细胞数量没有问题了。谢谢,呵呵。
普通的离心机基本上没有自动g与RPM转换的,飞鸽牌的(15毫升离心管用)我按照半径10cm(转速1000),离心1.5毫升EP管的离心机我按半径2cm计算离心力的(转速2230),从而得出要设置的转速2230。这对不对?公式按照高中物理公式计算的F=MRW2
5楼2010-10-13 13:55:33
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