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clbb1030

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】如何合成cDNA第二条链已有3人参与

想请教坛子里的高手，有人做过cDNA文库吗？我现在想合成cDNA的第二条链，可以采用什么方法呢？需要什么试剂？有合成第二条链的试剂盒吗？还有就是，合成的双链cDNA混合物还需要分开之后再连接载体吗？还是用双链混合物直接连载体，测序？谢谢！

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1楼 2010-09-09 10:32:32

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ben1147

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):热心的ben 2010-09-10 15:28:38

一个例子：
cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育2h，22℃温育2h
First Strand reaction mixture 40μl
10×E.Coli DNA ligase Buffer 16μl
10mM dNTP mix                   3μl
0.1M DTT                                     6μl
E.Coli DNA ligase (60U/μl)          0.25μl 15U
DNA Polymerase I (5U/μl)    10μl 50U
RNase H (5U/μl)                0.03μl 1.6U
H2O                               84.72μl
Final Volume                   160μl

试剂盒也有，比如Promega的Universal RiboClone  cDNA Synthesis System，里面就包含从RNA反转录成cDNA第一链，以及合成cDNA第二链所需的试剂

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2楼2010-09-09 11:56:02

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clbb1030

木虫 (小有名气)

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引用回帖:

Originally posted by ben1147 at 2010-09-09 11:56:02:
一个例子：
cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育2h，22℃温育2h
First Strand reaction mixture 40μl
10×E.Coli DNA ligase Buffer 16μl
10mM dNTP mix 3μl
0.1M DTT ...

谢谢高手指教，这个体系的前提是不是在我有第一条链的基础上的啊？

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3楼2010-09-09 12:24:12

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