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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何合成cDNA第二条链
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clbb1030

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】如何合成cDNA第二条链 已有3人参与

想请教坛子里的高手，有人做过cDNA文库吗？我现在想合成cDNA的第二条链，可以采用什么方法呢？需要什么试剂？有合成第二条链的试剂盒吗？还有就是，合成的双链cDNA混合物还需要分开之后再连接载体吗？还是用双链混合物直接连载体，测序？谢谢！
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1楼 2010-09-09 10:32:32
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):热心的ben 2010-09-10 15:28:38
一个例子：
cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育2h，22℃温育2h
First Strand reaction mixture        40μl       
10×E.Coli DNA ligase Buffer        16μl       
10mM dNTP mix                          3μl       
0.1M DTT                                          6μl       
E.Coli DNA ligase (60U/μl)           0.25μl        15U
DNA Polymerase I (5U/μl)         10μl        50U
RNase H (5U/μl)                       0.03μl        1.6U
H2O                                     84.72μl       
Final Volume                        160μl       


试剂盒也有，比如Promega的Universal RiboClone  cDNA Synthesis System，里面就包含从RNA反转录成cDNA第一链，以及合成cDNA第二链所需的试剂
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2楼2010-09-09 11:56:02
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clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-09-09 11:56:02:
一个例子：
cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育2h，22℃温育2h
First Strand reaction mixture        40μl       
10×E.Coli DNA ligase Buffer        16μl       
10mM dNTP mix                          3μl       
0.1M DTT                   ...

谢谢高手指教，这个体系的前提是不是在我有第一条链的基础上的啊？
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3楼2010-09-09 12:24:12
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by clbb1030 at 2010-09-09 12:24:12:

谢谢高手指教，这个体系的前提是不是在我有第一条链的基础上的啊？

是的

第一链合成就是一般的反转录反应，这个应该好找吧
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4楼2010-09-10 13:16:53
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clbb1030

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-09-10 13:16:53:

是的

第一链合成就是一般的反转录反应，这个应该好找吧

恩，我会做反转录。谢谢！非常感谢！
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5楼2010-09-11 10:55:29
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说说看

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by clbb1030 at 2010-09-11 10:55:29
恩，我会做反转录。谢谢！非常感谢！

你好，请问你最后用什么方法合成的cDNA第二条连，买的试剂盒还是用上面的体系自己合成的，结果怎么样我现在也遇到了很一样的问题，等待回答
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6楼2014-11-13 13:07:55
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