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linxi8579铜虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】overlapping PCR
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| 哪位大侠指点一下overlapping PCR的相关注意问题啊，我用cDNA做模板短的可以就是长的我都要绝望了。只好试一下overlapping PCR了，从引物设计到具体的protocal都想请教一下，多谢了。 |
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huainianshili
金虫 (正式写手)
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-02 22:58:49
linxi8579(金币+5): 2010-09-03 11:09:06
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-02 22:58:49
linxi8579(金币+5): 2010-09-03 11:09:06
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酶先试pyrobest。不行再用LA taq overlap 我用50nt 每个引物各分25nt加在5端。 一定用nest pcr 用两步法 两翼引物tm大于60度 按照这样 扩3.5kb以下的基本一次成功。4kb 以上的可能需要优化mg和退火温度。 以下文献最为关键： Shevchuk, N. A., A. V. Bryksin, et al. (2004). "Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously." Nucl. Acids Res. 32(2): e19-. |
2楼2010-09-02 22:18:24
taishanwei
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