应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办
754/8返回列表首页上一页234567下一页末页
查看: 5366  |  回复: 74
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
看天(金币+2):鼓励回答 2010-08-21 16:27:22
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:36:12
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找到最大的ORF及前端的UTR区。
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
31楼2010-08-21 16:23:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
看天:我有时也不小心会重复发帖 没事的 2010-08-21 16:27:48
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找到最大的ORF及前端的UTR区。
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
32楼2010-08-21 16:23:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whoisthis

铁虫 (小有名气)
★
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:38:57
silicare(金币+1):SMAR是个不错的方法 2010-08-24 12:57:58
SMAR rance 试剂盒最好用了
随便设计个温度高的引物就做出来了。也不用做什么巢式PCR.

还有就是用最新提的RNA
赞一下(1人) 回复此楼
33楼2010-08-21 20:12:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

siyuan4671

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:39:04
lstt09nk(金币+3):解释的很用心~~ 2010-08-22 13:00:16
鉴于你的结果，我 认为原因可能在于两方面：一是反转效率和得率，如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低，也会影响的，建议先做表达分析，看哪个组织表达量高，用哪个组织作模板；二可能是引物的问题，引物结合不好，很影响结果，得到的片段很短或者得不到有效扩增，建议不要贪心，紧靠5端不一定是最好的选择，有时候稍微靠内侧 效率高些能扩增3k左右的主带
如果条件允许，建议用invitrogen的kit
赞一下(1人) 回复此楼
34楼2010-08-21 20:35:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

siyuan4671

金虫 (小有名气)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:44
还有，如果片段太难扩，可以考虑Genome walking
赞一下(1人) 回复此楼
35楼2010-08-21 20:36:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:43:27
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:38
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-16 16:05:10:
我的RNA还可以，比值2.1，最差的也是1.9多，但就是做不出来，郁闷着呢

你说的比值不是越高越好啊，1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行，你要跑胶看一下RNA的完整性，有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻烦的。
赞一下 回复此楼
36楼2010-08-21 21:55:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-08-21 16:23:24:
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找 ...

不是基因组序列，不知道开放阅读框
赞一下 回复此楼
不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
37楼2010-08-22 12:36:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by siyuan4671 at 2010-08-21 20:35:25:
鉴于你的结果，我 认为原因可能在于两方面：一是反转效率和得率，如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低，也会影响的，建议先做表达分析，看哪个组织表达量高，用哪个组织作模板；二可能是引物的问题，引 ...

可能是表达量低吧，我用同样的模板扩核心片段就扩不太亮，怎么调整都扩不亮。。。。这个基因有时候扩的出来有时候扩不出来，模板相当难搞定，难办啊！
赞一下 回复此楼
不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
38楼2010-08-22 12:41:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-21 21:55:13:

你说的比值不是越高越好啊，1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行，你要跑胶看一下RNA的完整性，有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻 ...

跑胶了的，图片效果还好啊
赞一下 回复此楼
不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
39楼2010-08-22 12:43:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-24 12:00:12
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-22 12:43:48:

跑胶了的，图片效果还好啊

不知道你问题解决了没有啊，我想除了重新提RNA等一些步骤。你已知的序列是多长，是怎么知道的啊，可以先用自己的已知的尽量长的扩扩，相当于做个阳性对照了。还有反转的试剂盒是什么，如果反的比较长用随机引物效果好，这是我这两天刚知道的法宝。
赞一下 回复此楼
40楼2010-08-24 11:12:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 阳光金鱼唐 的主题更新
754/8返回列表首页上一页234567下一页末页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 123/6150 2026-08-19 23:44 by stan_et
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +12 基诺咪客 2026-08-17 16/800 2026-08-19 22:04 by kk 的小木虫
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +10 yuleib84 2026-08-18 11/550 2026-08-19 07:30 by 羽毛枫f
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭