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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
看天(金币+2):鼓励回答 2010-08-21 16:27:22
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:36:12
楼主做的生物知道基因组序列吗?如果知道的话,可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来,5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法,关键是RNA的质量,invitrogen的SII好用些,再用相关的GSP和UP来扩增,找到最大的ORF及前端的UTR区。
jiayoubashaonian
31楼2010-08-21 16:23:24
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

看天:我有时也不小心会重复发帖 没事的 2010-08-21 16:27:48
楼主做的生物知道基因组序列吗?如果知道的话,可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来,5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法,关键是RNA的质量,invitrogen的SII好用些,再用相关的GSP和UP来扩增,找到最大的ORF及前端的UTR区。
jiayoubashaonian
32楼2010-08-21 16:23:56
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whoisthis

铁虫 (小有名气)


阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:38:57
silicare(金币+1):SMAR是个不错的方法 2010-08-24 12:57:58
SMAR rance 试剂盒最好用了
随便设计个温度高的引物就做出来了。也不用做什么巢式PCR.

还有就是用最新提的RNA
33楼2010-08-21 20:12:28
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siyuan4671

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:39:04
lstt09nk(金币+3):解释的很用心~~ 2010-08-22 13:00:16
鉴于你的结果,我 认为原因可能在于两方面:一是反转效率和得率,如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低,也会影响的,建议先做表达分析,看哪个组织表达量高,用哪个组织作模板;二可能是引物的问题,引物结合不好,很影响结果,得到的片段很短或者得不到有效扩增,建议不要贪心,紧靠5端不一定是最好的选择,有时候稍微靠内侧 效率高些能扩增3k左右的主带
如果条件允许,建议用invitrogen的kit
34楼2010-08-21 20:35:25
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siyuan4671

金虫 (小有名气)

阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:44
还有,如果片段太难扩,可以考虑Genome walking
35楼2010-08-21 20:36:35
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:43:27
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:38
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-16 16:05:10:
我的RNA还可以,比值2.1,最差的也是1.9多,但就是做不出来,郁闷着呢

你说的比值不是越高越好啊,1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行,你要跑胶看一下RNA的完整性,有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻烦的。
36楼2010-08-21 21:55:13
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-08-21 16:23:24:
楼主做的生物知道基因组序列吗?如果知道的话,可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来,5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法,关键是RNA的质量,invitrogen的SII好用些,再用相关的GSP和UP来扩增,找 ...

不是基因组序列,不知道开放阅读框
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
37楼2010-08-22 12:36:53
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by siyuan4671 at 2010-08-21 20:35:25:
鉴于你的结果,我 认为原因可能在于两方面:一是反转效率和得率,如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低,也会影响的,建议先做表达分析,看哪个组织表达量高,用哪个组织作模板;二可能是引物的问题,引 ...

可能是表达量低吧,我用同样的模板扩核心片段就扩不太亮,怎么调整都扩不亮。。。。这个基因有时候扩的出来有时候扩不出来,模板相当难搞定,难办啊!
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
38楼2010-08-22 12:41:36
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-21 21:55:13:

你说的比值不是越高越好啊,1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行,你要跑胶看一下RNA的完整性,有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻 ...

跑胶了的,图片效果还好啊
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
39楼2010-08-22 12:43:48
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-24 12:00:12
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-22 12:43:48:

跑胶了的,图片效果还好啊

不知道你问题解决了没有啊,我想除了重新提RNA等一些步骤。你已知的序列是多长,是怎么知道的啊,可以先用自己的已知的尽量长的扩扩,相当于做个阳性对照了。还有反转的试剂盒是什么,如果反的比较长用随机引物效果好,这是我这两天刚知道的法宝。
40楼2010-08-24 11:12:36
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