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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
看天(金币+2):鼓励回答 2010-08-21 16:27:22
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:36:12
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找到最大的ORF及前端的UTR区。
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jiayoubashaonian
31楼2010-08-21 16:23:24
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
看天:我有时也不小心会重复发帖 没事的 2010-08-21 16:27:48
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找到最大的ORF及前端的UTR区。
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jiayoubashaonian
32楼2010-08-21 16:23:56
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whoisthis

铁虫 (小有名气)
★
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:38:57
silicare(金币+1):SMAR是个不错的方法 2010-08-24 12:57:58
SMAR rance 试剂盒最好用了
随便设计个温度高的引物就做出来了。也不用做什么巢式PCR.

还有就是用最新提的RNA
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33楼2010-08-21 20:12:28
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siyuan4671

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:39:04
lstt09nk(金币+3):解释的很用心~~ 2010-08-22 13:00:16
鉴于你的结果，我 认为原因可能在于两方面：一是反转效率和得率，如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低，也会影响的，建议先做表达分析，看哪个组织表达量高，用哪个组织作模板；二可能是引物的问题，引物结合不好，很影响结果，得到的片段很短或者得不到有效扩增，建议不要贪心，紧靠5端不一定是最好的选择，有时候稍微靠内侧 效率高些能扩增3k左右的主带
如果条件允许，建议用invitrogen的kit
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34楼2010-08-21 20:35:25
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siyuan4671

金虫 (小有名气)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:44
还有，如果片段太难扩，可以考虑Genome walking
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35楼2010-08-21 20:36:35
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:43:27
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-22 12:56:38
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-16 16:05:10:
我的RNA还可以，比值2.1，最差的也是1.9多，但就是做不出来，郁闷着呢

你说的比值不是越高越好啊，1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行，你要跑胶看一下RNA的完整性，有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻烦的。
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36楼2010-08-21 21:55:13
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-08-21 16:23:24:
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找 ...

不是基因组序列，不知道开放阅读框
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
37楼2010-08-22 12:36:53
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by siyuan4671 at 2010-08-21 20:35:25:
鉴于你的结果，我 认为原因可能在于两方面：一是反转效率和得率，如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低，也会影响的，建议先做表达分析，看哪个组织表达量高，用哪个组织作模板；二可能是引物的问题，引 ...

可能是表达量低吧，我用同样的模板扩核心片段就扩不太亮，怎么调整都扩不亮。。。。这个基因有时候扩的出来有时候扩不出来，模板相当难搞定，难办啊！
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
38楼2010-08-22 12:41:36
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-21 21:55:13:

你说的比值不是越高越好啊，1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行，你要跑胶看一下RNA的完整性，有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻 ...

跑胶了的，图片效果还好啊
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
39楼2010-08-22 12:43:48
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
阳光金鱼唐(金币+1): 2010-08-24 12:00:12
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2010-08-22 12:43:48:

跑胶了的，图片效果还好啊

不知道你问题解决了没有啊，我想除了重新提RNA等一些步骤。你已知的序列是多长，是怎么知道的啊，可以先用自己的已知的尽量长的扩扩，相当于做个阳性对照了。还有反转的试剂盒是什么，如果反的比较长用随机引物效果好，这是我这两天刚知道的法宝。
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40楼2010-08-24 11:12:36
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