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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】反相HPLC分离蛋白质
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sqhnsd

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】反相HPLC分离蛋白质 已有3人参与

有没有做过RP-HPLC分离蛋白的？交流一下， 我最近做的比较郁闷，分离效果不好
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1楼 2010-08-12 10:23:05
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):鼓励回答 2010-08-13 13:51:32
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-12 10:23:05:
有没有做过RP-HPLC分离蛋白的？交流一下， 我最近做的比较郁闷，分离效果不好

效果不好是个啥意思， 啥都没说，怎么交流呢？

RP hplc不是万能的，或者在说如果前面没有其他分离操作，rphplc啥都不是。

国内一些人为了写文章， 把 rp hplc吹的很高， 其实一种分离方法而已，你说有多牛？  利用的不过是疏水层析，能分的多好？
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2楼2010-08-13 12:54:33
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
你好，我的问题：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2285152&fpage=3
你可以看看我的图。
我的样品制备过程如下：
样品为大肠杆菌全蛋白，SDS-PAGE后按照分子量进行分离，后将不同分子量蛋白进行电洗脱，然后通过透析+丙酮沉淀去除盐和SDS，A、B图分离效果比较理想，分子量介于10-20 kDa组分，不同组分间上样量差别不大（2倍左右）。
可能的问题：
1.SDS没有除干净：这个不太可能，A、B分离还挺好，其他组分也都是同样的处理方式。
2.分子量大影响分离：C8柱子Pore size 300 A，之后换了pore size 为1000 A的（C含量介于C4 -C8）R2柱子，分离效果没有改善。
3. 流速：流速快可能影响传质效率，因此，在R2柱子上将流速降为0.5ml/min，其他条件不变，分离效果仍然没有改善。

所以，现在我不知道问题出在哪里，请高手指点。
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3楼2010-08-13 13:18:04
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 皖山潜凤 at 2010-08-13 12:54:33:



效果不好是个啥意思， 啥都没说，怎么交流呢？

RP hplc不是万能的，或者在说如果前面没有其他分离操作，rphplc啥都不是。

国内一些人为了写文章， 把 rp hplc吹的很高， 其实一种分离方法而已，你说有 ...

你好，我的问题：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2285152&fpage=3
你可以看看我的图。
我的样品制备过程如下：
样品为大肠杆菌全蛋白，SDS-PAGE后按照分子量进行分离，后将不同分子量蛋白进行电洗脱，然后通过透析+丙酮沉淀去除盐和SDS，A、B图分离效果比较理想，分子量介于10-20 kDa组分，不同组分间上样量差别不大（2倍左右）。
可能的问题：
1.SDS没有除干净：这个不太可能，A、B分离还挺好，其他组分也都是同样的处理方式。
2.分子量大影响分离：C8柱子Pore size 300 A，之后换了pore size 为1000 A的（C含量介于C4 -C8）R2柱子，分离效果没有改善。
3. 流速：流速快可能影响传质效率，因此，在R2柱子上将流速降为0.5ml/min，其他条件不变，分离效果仍然没有改善。

所以，现在我不知道问题出在哪里，请高手指点。
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4楼2010-08-13 13:18:58
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烟大考研

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-13 13:18:58:


你好，我的问题：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2285152&fpage=3
你可以看看我的图。
我的样品制备过程如下：
样品为大肠杆菌全蛋白，SDS-PAGE后按照分子量进行分离，后将不同 ...

我们用的是C18柱子，你说的那些柱子我都没有用过，这种柱子分离的蛋白小于120Kd，效果不错
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心信其可行，则移山填海之难，终有成功之日；心信其不可行，则反掌折枝之易，亦无收效之期
5楼2010-08-13 14:12:31
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 烟大考研 at 2010-08-13 14:12:31:

  我们用的是C18柱子，你说的那些柱子我都没有用过，这种柱子分离的蛋白小于120Kd，效果不错

真的啊，可能是个案吧，C18含碳量太大了
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6楼2010-08-13 15:15:52
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