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2008102037

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】沉默载体连接 已有4人参与

求助各位达人:

在构建沉默载体的时候,要将反向重复臂的两个片段A和B及内含子酶切下来连到表达载体上,但现在怎么都连不上,不知道问题出在哪里,所用的酶是BamHI和KpnI,所用的两个载体是没有问题的,已做出来过。但现在却不行了,想问问各位可碰到过类似情况?怎么解决的?
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
MM好像没有说明白啊~
2楼2010-08-06 18:11:34
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看天(金币+1):鼓励回答 好久不见你了 2010-08-07 00:15:18
切下来的片段再连回原来的载体看看能不能连上
看看是不是粘末端的问题
3楼2010-08-06 20:32:49
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2008102037

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-08-06 18:11:34:
MM好像没有说明白啊~

(⊙o⊙)…  哪没明白?
4楼2010-08-06 21:22:25
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2008102037

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-06 20:32:49:
切下来的片段再连回原来的载体看看能不能连上
看看是不是粘末端的问题

嗯,这倒是个办法,回去试试。多谢O(∩_∩)O~
5楼2010-08-06 21:22:54
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silicare

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引用回帖:
Originally posted by 2008102037 at 2010-08-06 21:22:25:




(⊙o⊙)…  哪没明白?

RNAi 怎么涉及到了内含子
6楼2010-08-07 10:50:01
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ben1147

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-08-07 10:50:01:




RNAi 怎么涉及到了内含子

沉默载体正、反向臂之间插入一段无关序列(异源内含子为佳)有利于dsRNA的形成,提高沉默效率
7楼2010-08-07 11:18:52
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silicare

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★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看天(金币+1):鼓励交流 2010-08-09 08:45:55
哦,是shRNA啊,那就是普通的酶切连接,是怎么个没连上,自连还是没有克隆

ps:那就是个颈环结构,不叫内含子。
8楼2010-08-09 08:35:30
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ymzfeng

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个可能是酶切位点出了问题
也可逐一检查下,看你原来的载体是否切开了
若载体都没切开,当然连接不上
这种RNA干扰载体是不是设计四个酶切位点要方便些
9楼2010-08-09 09:02:46
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