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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】沉默载体连接
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2008102037

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】沉默载体连接 已有4人参与

求助各位达人：

在构建沉默载体的时候，要将反向重复臂的两个片段A和B及内含子酶切下来连到表达载体上，但现在怎么都连不上，不知道问题出在哪里，所用的酶是BamHI和KpnI，所用的两个载体是没有问题的，已做出来过。但现在却不行了，想问问各位可碰到过类似情况？怎么解决的？
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1楼 2010-08-06 17:00:41
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silicare

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MM好像没有说明白啊~
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2楼2010-08-06 18:11:34
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励回答 好久不见你了 2010-08-07 00:15:18
切下来的片段再连回原来的载体看看能不能连上
看看是不是粘末端的问题
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3楼2010-08-06 20:32:49
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2008102037

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-08-06 18:11:34:
MM好像没有说明白啊~

(⊙o⊙)…  哪没明白？
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4楼2010-08-06 21:22:25
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2008102037

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-06 20:32:49:
切下来的片段再连回原来的载体看看能不能连上
看看是不是粘末端的问题

嗯，这倒是个办法，回去试试。多谢O(∩_∩)O~
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5楼2010-08-06 21:22:54
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silicare

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引用回帖:
Originally posted by 2008102037 at 2010-08-06 21:22:25:




(⊙o⊙)…  哪没明白？

RNAi 怎么涉及到了内含子
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6楼2010-08-07 10:50:01
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ben1147

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-08-07 10:50:01:




RNAi 怎么涉及到了内含子

沉默载体正、反向臂之间插入一段无关序列（异源内含子为佳）有利于dsRNA的形成，提高沉默效率
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7楼2010-08-07 11:18:52
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silicare

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看天(金币+1):鼓励交流 2010-08-09 08:45:55
哦，是shRNA啊，那就是普通的酶切连接，是怎么个没连上，自连还是没有克隆

ps：那就是个颈环结构，不叫内含子。
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8楼2010-08-09 08:35:30
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
★
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这个可能是酶切位点出了问题
也可逐一检查下，看你原来的载体是否切开了
若载体都没切开，当然连接不上
这种RNA干扰载体是不是设计四个酶切位点要方便些
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9楼2010-08-09 09:02:46
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