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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率？
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率？ 已有7人参与

最近在做一个TA克隆，经蓝白斑筛选后，得到白斑，经PCR鉴定，结果全为阴性！郁闷了，运气也实在太差了点，十几个菌落中都挑不出一个正向的！（PCR体系应该不会有问题，前几天刚做了另外一个重组的鉴定！）怎么样才能提高TA克隆的正向连接效率呢？做过的大虾们请指点一下！
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1楼 2010-07-19 09:02:03
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-19 22:23:21:
我问个问题啊，正反向怎么用PCR检测出来的？是用一个正向载体引物，和一个反向PCR引物检测的吗？

就是这个方法。。。
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12楼2010-08-15 10:04:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-19 09:16:57
何不直接双酶切克隆？位点很特殊？
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-07-19 09:07:31
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:07:31:
何不直接双酶切克隆？位点很特殊？

我们现在用的是T载体平台，想省掉PCR产物酶切这一步！
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3楼2010-07-19 09:18:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3):good！ 2010-07-19 20:10:15
引用回帖:
Originally posted by aofeng860308 at 2010-07-19 09:18:47:

我们现在用的是T载体平台，想省掉PCR产物酶切这一步！

也就是说纯克隆，不表达？
传统TA克隆是没办法定向的啵
我查到有个定向法，不过也是要经过酶切去掉反向重组质粒
http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-5/2010521173606846.htm

或者你考虑Invitrogen的TOPO定向克隆系统吧~~不够我没用过，但据说效果一流
http://zh.invitrogen.com/site/cn ... l-TOPO-cloning.html
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4楼2010-07-19 09:39:35
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