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【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 jinling158 的 15 个金币

jinling158

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】相对定量可以不做标准曲线吗已有3人参与

本人想做real time PCR, 做测试菌株和参照菌株之间A基因的表达差异,看了很多资料之后,觉得没有必要做标准曲线,原因如下:
目前主要用两种方法进行相对定量,其中之一是2-△△Ct法,该法前提是目的基因和参照基因有相同的扩增效率且接近100%;我认为用这种方法需要做标准曲线来看一下目的基因和参照基因的扩增效率是否相同。
另外一种方法是Pfaffl法,这种方法应用的前提是单个基因(目的基因和参照基因)在试验样本和标准样本中有相同的扩增效率,但不要求目的基因和参照基因有相同的扩增效率。但是用这种方法要知道目的基因和参照基因的扩增效率,请问一下做过的同学,如果不做标准曲线的话怎么知道目的基因和参照基因的扩增效率呢?另外,怎么确定单个基因在不同样本之间具有相同的扩增效率呢?

希望做过的童鞋发表一下您的高见,谢谢!

[ Last edited by jinling158 on 2010-7-2 at 17:37 ]
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kikie

木虫 (正式写手)

★ ★
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-06-29 21:04:33
jinling158(金币+1): 2010-06-30 11:22:17
jinling158(金币+1): 2010-07-02 17:38:02
所以要做,呵呵。
用2-△△Ct分析,先做标准曲线,看该引物在样品中扩增效率是否一致,否则需要调整。
性痴则志凝,故书痴者文必工,艺痴者技必良;世之落拓无成者,皆自谓不痴者也
2楼2010-06-29 20:50:24
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jinling158

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by kikie at 2010-06-29 20:50:24:
所以要做,呵呵。
用2-△△Ct分析,先做标准曲线,看该引物在样品中扩增效率是否一致,否则需要调整。

我知道用2-△△Ct分析要做标准曲线,我的意思是说Pfall方法用不用做?
3楼2010-06-30 11:23:22
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weiyang1386

金虫 (小有名气)

jinling158(金币+1): 2010-07-08 11:04:39
jinling158(金币+1):对的 2010-07-08 11:05:22
jinling158(金币+1): 2010-07-08 11:05:39
这样一般如果不用一楼的做法,貌似还是要用不同浓度的样品做管家基因和样品分别作曲线,即双标发,然后以样品对管家基因的比值来相对定量。
如果说的不对见谅啊!
4楼2010-07-07 18:26:06
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jinling158

铜虫 (小有名气)

楼上的说得对,我现在已经有思路了,谢谢参与!
5楼2010-07-08 11:06:29
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