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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】原核表达 蛋白没有表达求助! 已有12人参与

构建了3个融合基因片段,倒入PQE30载体,测序正确后,诱导表达只有1个蛋白表达了,条件都是一样的
转化,摇菌12H,菌液PCR验证正确,转接, 37℃2.5H ,1:50转接 37℃,1MMOL/L IPTG 1:1000 诱导3H,超声裂菌,SDS-PAGE结果其中的一个表达了,2个没有表达,求助,谢谢!
有位虫友告诉我 让我重新连接,转化,可是我测序是正确的啊! 不知道是什么原因?

[ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-6-29 at 21:42 ]
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

jiangkuo0520(金币+1):xiexie 2010-07-17 16:51:54
在确定序列无误的情况下,可以37度诱导后先跑全细胞电泳,确认是否有蛋白。分析核酸序列中大肠杆菌稀有密码子情况,更换宿主。此外,如果这个蛋白是膜蛋白的话,可能就需要花点时间长期抗战了
20楼2010-07-10 15:59:56
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tigerpaw

木虫 (正式写手)

有没有跑琼脂糖凝胶验证一下转进去了没有?
聪明的人能洞察事物未来的发展趋势,他们在洪水来之前养鸭而不养鸡。
2楼2010-06-28 09:23:22
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by tigerpaw at 2010-06-28 09:23:22:
有没有跑琼脂糖凝胶验证一下转进去了没有?

做了菌液PCR,有目的条带
3楼2010-06-28 09:31:13
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客


看天(金币+1):鼓励回答 2010-06-28 09:33:52
pcr假阳性太多了
不过不表达也是常事
还有表达了,表达量不大也是常事
或者是蛋白对菌活性有毒性,不表达也正常
恩,还有载体的突变问题……
太多了,具体问题要具体分析……
For my life!
4楼2010-06-28 09:32:50
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