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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因工程菌诱导蛋白表达的问题
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Dream_鬼鬼

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】基因工程菌诱导蛋白表达的问题 已有7人参与

目前正在做通过重组大肠杆菌发酵产酶，该酶为胞内酶，主要的发酵过程分为两个阶段，第一阶段，37℃培养产生菌体，培养一定时间后开始进入第二阶段，降温诱导，需要加入诱导剂乳糖。现在有个疑问的就是，我在加入诱导剂的同时在发酵液中补入一定量的一种糖（这种糖为该酶转化时的底物），待诱导结束后测定酶活发现（将诱导阶段加入该酶的底物与不加该酶的底物进行比较）：①.在诱导阶段加入该酶底物该酶酶活增加。②.在两种情况下的蛋白质含量差别不大。③.比酶活增加。
    以上现象是否可以认定是蛋白的表达量增加，同时想咨询一下有没有哪位朋友涉及到该方面内容的，或是有看到过有类似现象的文献报道的，希望大家能够给点建议这方面接下来应该怎么去分析。
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1楼 2010-06-25 14:13:37
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
Dream_鬼鬼(金币+1): 2010-06-26 09:50:37
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-26 12:11:48
对于糖苷酶来说，有些糖类 对酶活力由促进作用。比如说有些beta-葡萄糖苷酶，在反应体系中加入酶的水解产物会是酶活力提高到原来的2倍以上。
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5楼2010-06-25 19:53:40
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普通回帖

liouwzh

木虫 (正式写手)
★
看天(金币+1): 2010-06-25 22:13:28
Dream_鬼鬼(金币+1): 2010-06-26 09:50:45
我觉得可以通过PAGE电泳来分析目的蛋白的量是否增加。
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2楼2010-06-25 15:31:07
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Dream_鬼鬼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liouwzh at 2010-06-25 15:31:07:
我觉得可以通过PAGE电泳来分析目的蛋白的量是否增加。

蛋白质含量我通过考马斯亮蓝法测过了，我疑惑的是我在诱导阶段加入底物（一种糖可以作为碳源）是否会对诱导酶活产生促进作用。
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3楼2010-06-25 15:40:55
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Dream_鬼鬼

新虫 (小有名气)
有人能回答一下吗？
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4楼2010-06-25 19:43:34
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看天

木虫 (知名作家)
我觉得不一定是显著增加 酶在有底物时表现出较强的催化活力 没底物时相对来讲就较低 可能是细胞基于经济性的一个调控特性  不知道楼主测酶活的具体手段是什么 应该不会是直接拿发酵液测定吧
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
6楼2010-06-25 22:18:10
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Dream_鬼鬼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 看天 at 2010-06-25 22:18:10:
我觉得不一定是显著增加 酶在有底物时表现出较强的催化活力 没底物时相对来讲就较低 可能是细胞基于经济性的一个调控特性  不知道楼主测酶活的具体手段是什么 应该不会是直接拿发酵液测定吧

由于是胞内酶，我测酶活的方法就是，发酵结束收集菌体，加缓冲洗涤一次，在菌体中加入底物进行酶转化，最后通过测定产物的量去计算酶活。
而我在发酵的诱导阶段加入底物后，酶的比活增加，想请教一下大家有没有看过类似方面的文献报道，可以给我参考一下。同时如果去研究这里面的机理应该从哪个方面去做，谢谢。
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7楼2010-06-26 10:00:14
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by Dream_鬼鬼 at 2010-06-26 10:00:14:

由于是胞内酶，我测酶活的方法就是，发酵结束收集菌体，加缓冲洗涤一次，在菌体中加入底物进行酶转化，最后通过测定产物的量去计算酶活。
而我在发酵的诱导阶段加入底物后，酶的比活增加，想请教一下大家有没有 ...

当然我也是推测一下 具体的也不是很清楚 因为方向不对 限于能力不能有所帮组
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
8楼2010-06-26 10:04:46
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Dream_鬼鬼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 看天 at 2010-06-26 10:04:46:

当然我也是推测一下 具体的也不是很清楚 因为方向不对 限于能力不能有所帮组

嗯，还是很谢谢你。
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9楼2010-06-26 10:08:47
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
看天(金币+1):谢谢交流 2010-06-26 11:10:46
蛋白质含量差别不大是怎么检测的，另一种思路，总之酶活增加了做个定量实验也许可以。从RNA水平上看一下。
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10楼2010-06-26 10:47:09
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