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guojing0000

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】紧急求助关于单细胞凝胶电泳实验已有11人参与

我最近在做彗星实验，但是很奇怪的是实验过程中不知道存在什么问题，跑完电泳后就看不到细胞了，视野是一片漆黑啊，呜呜呜，很伤心，希望大家给我找找原因。
具体的实验方法如下：
2.1电泳胶板的制作
移液枪吸取10μL 1%正常熔点琼脂糖，至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出，置于冰上面。然后吸取150μL0. 5％正常熔点琼脂糖，待胶稍微凝固加上洁净的盖玻片，至至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出。之后用手指肚缓慢滑去盖玻片。吸取25μL细胞悬浮液与75μL低熔点琼脂糖混和，迅速将细胞混合液滴到第一层胶上，加盖玻片让其均匀铺开，置4℃15min，使琼脂固化。
2.2细胞裂解
移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4℃裂解液中，在4℃冰箱中放置至少1h，但时间不能过长，长时间的裂解可能导致裂解液沉淀。
2.3 DNA解旋
轻轻移去盖玻片后将载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中盛有新配制碱性电泳缓冲液，约覆过载玻片2.5mm，放置30min。
2.4电泳
调整电泳槽中缓冲液面高度，使电泳仪的电压为25V(恒压)，电流为300mA，电泳20min。
2.5中和、染色
电泳结束后取出玻片用蒸馏水冲洗3次，并用滤纸吸去多余的水分，放小瓷盘，沿器壁加入0.4mol•L-1Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液，中和3次，每次5分钟，中间更换中和液。
2.6观察和分析：
各组载玻片加入染色剂染色5min后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数。
3．实验试剂配制方法
试剂的配置：
正常熔点的琼脂（normal melting agarose）；低熔点的琼脂（low melting agarose）；Tris；肌氨酸钠（Sodium sarcosinate）；Triton X-100；DMSO（dimethyl sulfoxide；二甲基亚砜）； EB（ethidium bromide）；NaCl；Na2EDTA；EDTA；NaOH；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；乙醇
1%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
配 10ml 需琼脂为：0.1g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。
0.5%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
配 5ml 需琼脂为：0.05g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。
0.7%低熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
配 10ml 需琼脂为：0.7g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至37摄氏度，观察到澄清透明时方可。
细胞裂解液（4℃）：
2.5M NaCl；100mM Na2EDTA；10mM Tris；调pH至10；1%肌氨酸钠；临用前加1% Triton X-100，10% DMSO
配500ml 需：NaCl 73.05g；Na2EDTA 18.61g；Tris 0.61g；肌氨酸钠5g；Triton X-100 5ml；DMSO 50ml，NaOH 4g
配制方法：先用300ml灭菌水溶解NaOH 4g，然后加入肌氨酸钠，用磁力搅拌加热溶解，然后再加入其它物质。临用前1小时加入1% Triton X-100，10% DMSO，磁力搅拌无固体后，放入4摄氏度冰箱。
电泳缓冲液：
1mM Na2EDTA和300mM NaOH，调pH＞13，现用现配。
pH 7.5，0.4M Tris：
配100ml需Tris为：4.8456g，加尽量少的水溶解，用HCl调节pH=7.5
碘化丙锭PI水溶液：2mg/l EB染色剂（4℃暗处保存）

需要补充一句的是，我的PI是去年1月份配置的，放置到现在采用，请问可以吗？配置时的浓度是100mg/l的，现在每次使用前稀释。
希望大家知无不言，言无不尽啊，我实在是找不到原因了啊
谢谢各位大虾啦！

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1楼2010-06-01 11:16:02

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swallow675

木虫 (小有名气)

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1楼: Originally posted by guojing0000 at 2010-06-01 11:16:02:
我最近在做彗星实验，但是很奇怪的是实验过程中不知道存在什么问题，跑完电泳后就看不到细胞了，视野是一片漆黑啊，呜呜呜，很伤心，希望大家给我找找原因。
具体的实验方法如下：
2.1电泳胶板的制作
移液枪吸 ...

同学您好我想请问一下能把你们的彗星分析软件发给我一份吗万分感谢