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guojing0000木虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】紧急求助关于单细胞凝胶电泳实验已有11人参与
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我最近在做彗星实验，但是很奇怪的是实验过程中不知道存在什么问题，跑完电泳后就看不到细胞了，视野是一片漆黑啊，呜呜呜，很伤心，希望大家给我找找原因。 具体的实验方法如下： 2.1电泳胶板的制作 移液枪吸取10μL 1%正常熔点琼脂糖，至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出，置于冰上面。然后吸取150μL0. 5％正常熔点琼脂糖，待胶稍微凝固加上洁净的盖玻片，至至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出。之后用手指肚缓慢滑去盖玻片。吸取25μL细胞悬浮液与75μL低熔点琼脂糖混和，迅速将细胞混合液滴到第一层胶上，加盖玻片让其均匀铺开，置4℃15min，使琼脂固化。 2.2细胞裂解 移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4℃裂解液中，在4℃冰箱中放置至少1h，但时间不能过长，长时间的裂解可能导致裂解液沉淀。 2.3 DNA解旋 轻轻移去盖玻片后将载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中盛有新配制碱性电泳缓冲液，约覆过载玻片2.5mm，放置30min。 2.4电泳 调整电泳槽中缓冲液面高度，使电泳仪的电压为25V(恒压)，电流为300mA，电泳20min。 2.5中和、染色 电泳结束后取出玻片用蒸馏水冲洗3次，并用滤纸吸去多余的水分，放小瓷盘，沿器壁加入0.4mol•L-1Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液，中和3次，每次5分钟，中间更换中和液。 2.6观察和分析： 各组载玻片加入染色剂染色5min后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数。 3． 实验试剂配制方法 试剂的配置： 正常熔点的琼脂（normal melting agarose）；低熔点的琼脂（low melting agarose）；Tris；肌氨酸钠（Sodium sarcosinate）；Triton X-100；DMSO（dimethyl sulfoxide；二甲基亚砜）； EB（ethidium bromide）；NaCl；Na2EDTA；EDTA；NaOH；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；乙醇 1%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 10ml 需琼脂为：0.1g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。 0.5%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 5ml 需琼脂为：0.05g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。 0.7%低熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 10ml 需琼脂为：0.7g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至37摄氏度，观察到澄清透明时方可。 细胞裂解液（4℃）： 2.5M NaCl；100mM Na2EDTA；10mM Tris；调pH至10；1%肌氨酸钠；临用前加1% Triton X-100，10% DMSO 配500ml 需：NaCl 73.05g；Na2EDTA 18.61g；Tris 0.61g；肌氨酸钠5g；Triton X-100 5ml；DMSO 50ml，NaOH 4g 配制方法：先用300ml灭菌水溶解NaOH 4g，然后加入肌氨酸钠，用磁力搅拌加热溶解，然后再加入其它物质。临用前1小时加入1% Triton X-100，10% DMSO，磁力搅拌无固体后，放入4摄氏度冰箱。 电泳缓冲液： 1mM Na2EDTA和300mM NaOH，调pH＞13，现用现配。 pH 7.5，0.4M Tris： 配100ml需Tris为：4.8456g，加尽量少的水溶解，用HCl调节pH=7.5 碘化丙锭PI水溶液：2mg/l EB染色剂（4℃暗处保存） 需要补充一句的是，我的PI是去年1月份配置的，放置到现在采用，请问可以吗？配置时的浓度是100mg/l的，现在每次使用前稀释。 希望大家知无不言，言无不尽啊，我实在是找不到原因了啊 谢谢各位大虾啦！ |
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