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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】紧急求助关于单细胞凝胶电泳实验
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guojing0000

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】紧急求助关于单细胞凝胶电泳实验 已有11人参与

我最近在做彗星实验，但是很奇怪的是实验过程中不知道存在什么问题，跑完电泳后就看不到细胞了，视野是一片漆黑啊，呜呜呜，很伤心，希望大家给我找找原因。
具体的实验方法如下：
2.1电泳胶板的制作
移液枪吸取10μL 1%正常熔点琼脂糖，至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出，置于冰上面。然后吸取150μL0. 5％正常熔点琼脂糖，待胶稍微凝固加上洁净的盖玻片，至至4℃冷却。待胶凝固（15min）后取出。之后用手指肚缓慢滑去盖玻片。吸取25μL细胞悬浮液与75μL低熔点琼脂糖混和，迅速将细胞混合液滴到第一层胶上，加盖玻片让其均匀铺开，置4℃15min，使琼脂固化。
2.2细胞裂解
    移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4℃裂解液中，在4℃冰箱中放置至少1h，但时间不能过长，长时间的裂解可能导致裂解液沉淀。
2.3 DNA解旋
    轻轻移去盖玻片后将载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中盛有新配制碱性电泳缓冲液，约覆过载玻片2.5mm，放置30min。
2.4电泳
    调整电泳槽中缓冲液面高度，使电泳仪的电压为25V(恒压)，电流为300mA，电泳20min。
2.5中和、染色
    电泳结束后取出玻片用蒸馏水冲洗3次，并用滤纸吸去多余的水分，放小瓷盘，沿器壁加入0.4mol•L-1Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液，中和3次，每次5分钟，中间更换中和液。
2.6观察和分析：
    各组载玻片加入染色剂染色5min后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数。
3．        实验试剂配制方法
试剂的配置：
正常熔点的琼脂（normal melting agarose）；低熔点的琼脂（low melting agarose）；Tris；肌氨酸钠（Sodium sarcosinate）；Triton X-100；DMSO（dimethyl sulfoxide；二甲基亚砜）； EB（ethidium bromide）；NaCl；Na2EDTA；EDTA；NaOH；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；乙醇
1%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
    配 10ml   需琼脂为：0.1g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。
0.5%正常熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
    配 5ml   需琼脂为：0.05g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至95摄氏度，观察到澄清透明时方可。
0.7%低熔点的琼脂（无Ca2+、Mg2+的PBS配制）：
    配 10ml   需琼脂为：0.7g，称量完放入水浴锅，使水浴锅温度不断上升至37摄氏度，观察到澄清透明时方可。
细胞裂解液（4℃）：
    2.5M NaCl；100mM Na2EDTA；10mM Tris；调pH至10；1%肌氨酸钠；临用前加1% Triton X-100，10% DMSO
配500ml 需：NaCl 73.05g；Na2EDTA 18.61g；Tris 0.61g；肌氨酸钠5g；Triton X-100 5ml；DMSO 50ml，NaOH 4g
配制方法：先用300ml灭菌水溶解NaOH 4g，然后加入肌氨酸钠，用磁力搅拌加热溶解，然后再加入其它物质。临用前1小时加入1% Triton X-100，10% DMSO，磁力搅拌无固体后，放入4摄氏度冰箱。
电泳缓冲液：
    1mM Na2EDTA和300mM NaOH，调pH＞13，现用现配。
pH 7.5，0.4M Tris：
    配100ml需Tris为：4.8456g，加尽量少的水溶解，用HCl调节pH=7.5
碘化丙锭PI水溶液：2mg/l EB染色剂（4℃暗处保存）

需要补充一句的是，我的PI是去年1月份配置的，放置到现在采用，请问可以吗？配置时的浓度是100mg/l的，现在每次使用前稀释。
希望大家知无不言，言无不尽啊，我实在是找不到原因了啊
谢谢各位大虾啦！
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1楼 2010-06-01 11:16:02
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angel619

新虫 (初入文坛)

彗星实验

★
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如果细胞没有应该可能是你把细胞稀释的太少了，我们做这个实验也是，细胞多了不是，少了也不是，但是我们现在老是脱胶，请问你们的容易脱胶吗？
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2楼2010-11-24 09:48:16
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guojing0000

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by angel619 at 2010-11-24 09:48:16:
如果细胞没有应该可能是你把细胞稀释的太少了，我们做这个实验也是，细胞多了不是，少了也不是，但是我们现在老是脱胶，请问你们的容易脱胶吗？

我的问题已经解决了，是PH的问题
我们还好啦，第一层胶铺大点，用专用的磨砂玻片，脱胶还好啦
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3楼2010-11-24 22:41:48
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laq3389797

银虫 (初入文坛)
★
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你的细胞是怎么分离的啊？我用的机械法和酶法，效果都不怎么好。
而且我不知道怎么检测细胞核时候从根尖上脱落下来了。
我做的是大豆根尖细胞，太脑壳痛了啊！！！
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NeverUnderestiamatetheheartofachampion
4楼2011-08-02 15:30:01
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swallow675

木虫 (小有名气)
★
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1楼: Originally posted by guojing0000 at 2010-06-01 11:16:02:
我最近在做彗星实验，但是很奇怪的是实验过程中不知道存在什么问题，跑完电泳后就看不到细胞了，视野是一片漆黑啊，呜呜呜，很伤心，希望大家给我找找原因。
具体的实验方法如下：
2.1电泳胶板的制作
移液枪吸 ...

同学  您好  我想请问一下  能把你们的彗星分析软件发给我一份吗  万分感谢
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5楼2011-11-14 21:27:26
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houjinpao

新虫 (初入文坛)
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【求助】关于酵母彗星实验
    最近在做彗星实验，用的材料是酵母细胞，照出来的图片没有拖尾现象，而是圆圆的红色小点，中心亮一些，四周暗一些，我用的染料是PI。不知怎么回事。各位大侠有没有经验？谢谢了！
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6楼2012-04-27 20:17:36
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冰蓝哎呦呦

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by guojing0000 at 2010-11-24 22:41:48
我的问题已经解决了，是PH的问题
我们还好啦，第一层胶铺大点，用专用的磨砂玻片，脱胶还好啦...

我现在做彗星实验，就是视野里找不到细胞，但是背景很亮，这怎么弄呢
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7楼2014-03-14 15:26:32
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靓靓生物

新虫 (初入文坛)
★
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你在去玻片时，是划去盖玻片？
我的做法是用刀片轻轻弹掉，防止胶跟着盖玻片粘着  去掉了
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8楼2014-04-13 20:24:42
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好饿啊少爷

新虫 (初入文坛)
★
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我还没做到你的这一步，我主要是电泳时候电泳仪显示短路，不知怎么办，所用的电泳液也是和你一样配制的。不知道原因
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9楼2014-04-18 09:32:35
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yrc880306

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7楼: Originally posted by 冰蓝哎呦呦 at 2014-03-14 15:26:32
我现在做彗星实验，就是视野里找不到细胞，但是背景很亮，这怎么弄呢...

我的也是啊。好捉急啊，求大神
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10楼2014-12-29 17:54:35
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