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jackiechan

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr已有5人参与

请根据照片帮忙分析pcr失败原因，目的片断是1800 bp,用的是上海生工taq酶,谢谢


[ Last edited by jackiechan on 2010-5-18 at 16:45 ]
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1楼2010-05-18 16:44:09
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695

木虫 (职业作家)
★
1949stone(金币+1):同意 2010-05-18 18:22:27
最好把体系各成分用量也列出来,然后退火或引物的Tm大家可能帮你解决更清晰
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2楼2010-05-18 18:16:49
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christina1213

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-18 22:26:47
把你的体系，目的带的大小和有相关信息列下（比如GC含量之类的），不然看图真看不出什么，如果是底下的那两条带，可以多加些模板，或者加5%-10%的DMSO试试，可能会改观下
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3楼2010-05-18 18:56:00
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gaiyf

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-18 22:26:51
出现上述情况的原因可能有以下几个方面：1、酶量过多。2 酶的质量差 3 dNTP浓度过高。 4 Mg离子浓度过高。 5退火温度过低。6 循环次数过多。 7 模板质量差，有蛋白质等杂质影响。
具体什么愿意楼主自己在仔细查一下吧
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多看文献，多学知识
4楼2010-05-18 20:16:26
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虫虫博士

新虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-18 22:26:55
没有扩增迹象，但是可以看出，你的酶系统是没有问题的，关键是你的引物不能结合到模板上或者此酶不适合这种长片段的扩增。建议先换更好的酶，如果不能扩，就考虑引物。
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5楼2010-05-18 21:17:29
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jackiechan

木虫 (小有名气)

基因组和pcr条件





模版不是图片上的用量,模版是稀释200 400 800倍各1微升,分别对应图片上的1、0.5、0.25
酶1微升
mg++用的是25mm的那种
引物各1微升
50微升体系
各2个平行
目的条带应该是1800bp
大肠杆菌基因组是自己提的，没用试剂盒，不只是否有蛋白质等杂志污染而影响pcr，如果有蛋白质是否应该流在点样孔，而我的点样孔不亮

[ Last edited by jackiechan on 2010-5-18 at 21:53 ]
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6楼2010-05-18 21:33:48
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