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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】各位大侠，请教个问题！
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ottolzm

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】各位大侠，请教个问题！ 已有3人参与

各位大侠，我前段时间在坛子里学到了不少关于PCR和基因工程的经验，今天来此想请教大家，我已经将我所需要的基因组DNA提取出来了，我用试剂盒提取的，链霉菌菌体量大概覆盖住1.5毫升离心管底部，最后用50微升无菌水溶解，吸取4微升进行电泳检测，虽然条带正常 ，但是浓度我总觉得不够，请教大家，这样能否进行下一步，PCR，？还有就是在进行PCR时那个经典的反应的温度除了退火温度以外 其他的需不需要改变？这个退火温度是引物在没加酶切位点前的温度，还是加了酶切位点后的温度，因为Oligo分析，这两个温度是不一样的，呵呵 虽然是菜鸟级的问题，但是对我却是极为重要的问题，谢谢大家的帮助，祝坛子“越来越大，越来越深”！！！
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1楼 2010-05-17 20:27:02
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR的话模板2.5ug就够了，你真不放心就测个OD值
那个退火温度不一样是指导两对不同的引物还是什么？
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2楼2010-05-17 21:55:43
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ottolzm

木虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1):积极交流奖 2010-05-18 09:49:07
呵呵 谢谢楼上的  yinsongna   那个退火温度是我给引物加了酶切位点和没有加酶切位点时 Oligo分析的退火温度 两个温度不一样 我现在不明白的是 在做PCR的时候 应该是用哪一个退火温度来作为我PCR的退火温度
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3楼2010-05-18 08:23:35
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-18 09:48:43
最好的是先用不带酶切位点的退火温度跑5个循环，再用带酶切位点的退火温度跑25-30个循环，

变性及延伸时间请参照所用的酶的说明书，不同的酶最佳条件稍有差别的
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4楼2010-05-18 09:04:52
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ottolzm

木虫 (正式写手)
呵呵 谢谢楼上的各位大侠
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5楼2010-05-18 20:53:06
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