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ottolzm

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】各位大侠,请教个问题! 已有3人参与

各位大侠,我前段时间在坛子里学到了不少关于PCR和基因工程的经验,今天来此想请教大家,我已经将我所需要的基因组DNA提取出来了,我用试剂盒提取的,链霉菌菌体量大概覆盖住1.5毫升离心管底部,最后用50微升无菌水溶解,吸取4微升进行电泳检测,虽然条带正常 ,但是浓度我总觉得不够,请教大家,这样能否进行下一步,PCR,?还有就是在进行PCR时那个经典的反应的温度除了退火温度以外 其他的需不需要改变?这个退火温度是引物在没加酶切位点前的温度,还是加了酶切位点后的温度,因为Oligo分析,这两个温度是不一样的,呵呵 虽然是菜鸟级的问题,但是对我却是极为重要的问题,谢谢大家的帮助,祝坛子“越来越大,越来越深”!!!
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ottolzm

木虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1):积极交流奖 2010-05-18 09:49:07
呵呵 谢谢楼上的  yinsongna   那个退火温度是我给引物加了酶切位点和没有加酶切位点时 Oligo分析的退火温度 两个温度不一样 我现在不明白的是 在做PCR的时候 应该是用哪一个退火温度来作为我PCR的退火温度
3楼2010-05-18 08:23:35
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yinsongna

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR的话模板2.5ug就够了,你真不放心就测个OD值
那个退火温度不一样是指导两对不同的引物还是什么?
2楼2010-05-17 21:55:43
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jasco

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-18 09:48:43
最好的是先用不带酶切位点的退火温度跑5个循环,再用带酶切位点的退火温度跑25-30个循环,

变性及延伸时间请参照所用的酶的说明书,不同的酶最佳条件稍有差别的
4楼2010-05-18 09:04:52
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ottolzm

木虫 (正式写手)

呵呵 谢谢楼上的各位大侠
5楼2010-05-18 20:53:06
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