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jingcp200320银虫 (小有名气)
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细胞总蛋白的提取 一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或 （10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室 温),加入饱和浓度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后 （迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4 ,5mM EDTA,10mM NaF））, 离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度 108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。 二．裂解缓冲液： 50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4 150-300mM NaCl 1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA（现加1ml加10ul） 临用前加入蛋白酶抑制剂： Na3VO4 钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml) （用0.2mol/L储存液配制） PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul） Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml） (Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting 三．给你介绍一个裂解液： 50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含： NaCl 150mM 叠氮钠 0.02% SDS 0.1% NP-40 1% PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。 四．我的样品蛋白是这样制备的： １．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来 ２．离心收集细胞 ３．向离心管里加入４０微升１×PBS 缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamily buffer （由tris碱和SDS 组成）裂解细胞 ４．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心． ５．测定蛋白浓度，加样电泳 我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没 问题。 五．碧云天公司技术支持 Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。(-20 ℃保存，一年有效。) 如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量 的1/20）加入裂解液。 六．军科院技术支持 裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml PMSF）： 1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF 至终浓度为100ug/ml（0.87ml 裂解液 加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 七．操作方法： 蛋白样品制备： （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。） 4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。 5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于－20 度保存。 |
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