| 查看: 10173 | 回复: 17 | ||||
jingcp200320银虫 (小有名气)
|
[交流]
【分享】高人整理的细胞总蛋白的提取 已有17人参与
|
|
细胞总蛋白的提取 一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或 （10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室 温),加入饱和浓度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后 （迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4 ,5mM EDTA,10mM NaF））, 离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度 108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。 二．裂解缓冲液： 50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4 150-300mM NaCl 1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA（现加1ml加10ul） 临用前加入蛋白酶抑制剂： Na3VO4 钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml) （用0.2mol/L储存液配制） PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul） Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml） (Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting 三．给你介绍一个裂解液： 50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含： NaCl 150mM 叠氮钠 0.02% SDS 0.1% NP-40 1% PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml) 尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。 四．我的样品蛋白是这样制备的： １．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来 ２．离心收集细胞 ３．向离心管里加入４０微升１×PBS 缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamily buffer （由tris碱和SDS 组成）裂解细胞 ４．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心． ５．测定蛋白浓度，加样电泳 我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没 问题。 五．碧云天公司技术支持 Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。(-20 ℃保存，一年有效。) 如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量 的1/20）加入裂解液。 六．军科院技术支持 裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml PMSF）： 1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF 至终浓度为100ug/ml（0.87ml 裂解液 加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 七．操作方法： 蛋白样品制备： （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。） 4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。 5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于－20 度保存。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 生物科学 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
1013826022» 猜你喜欢
323求调剂
已经有6人回复
-
一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂
已经有4人回复
-
352求调剂
已经有3人回复
-
一志愿东华大学化学070300，求调剂
已经有8人回复
-
277材料科学与工程080500求调剂
已经有7人回复
-
317求调剂
已经有18人回复
-
293求调剂
已经有5人回复
-
280分求调剂 一志愿085802
已经有7人回复
-
0854电子信息求调剂
已经有3人回复
-
263求调剂
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- TCA/丙酮沉淀法提取牛肌肉总蛋白，总是缺失大分量蛋白的原因在哪呢？
已经有5人回复
- 【资料】植物总蛋白提取方法
已经有80人回复
- 双向蛋白提取，有没有提出的总蛋白，是干粉状的直接可以跑双向的
已经有7人回复
- 柞蚕总RNA提取中，蛋白抽提不尽
已经有12人回复
- 动物细胞蛋白提取含量低
已经有11人回复
- 【求助/交流】请教高手关于从细胞中提取总RNA
已经有8人回复
- 【求助/交流】细胞核内蛋白和细胞浆蛋白提取有什么区别？
已经有4人回复
- 【求助/交流】真菌菌丝体细胞破碎（提取蛋白质）方法
已经有8人回复
- 【求助/交流】革兰氏阳性菌细胞2D用总蛋白样品制备方法？
已经有4人回复
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
| 谢谢分享 |
2楼2010-04-27 15:03:42
度百
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 5226.9
- 散金: 21
- 红花: 3
- 帖子: 581
- 在线: 228.7小时
- 虫号: 897115
- 注册: 2009-11-08
- 专业: 建筑学
3楼2010-04-30 10:32:24
4楼2010-04-30 10:34:47
daodi07
木虫 (著名写手)
小木虫之超级fan
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 2590.2
- 散金: 319
- 红花: 7
- 帖子: 1103
- 在线: 363小时
- 虫号: 388556
- 注册: 2007-05-31
- 性别: GG
- 专业: 其他无机非金属材料
5楼2010-04-30 10:36:55
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
| 谢谢分享 |
6楼2010-05-06 10:29:58
Rubisco580
金虫 (小有名气)
- BioEPI: 4
- 应助: 66 (初中生)
- 金币: 997.7
- 红花: 7
- 帖子: 264
- 在线: 48.5小时
- 虫号: 553802
- 注册: 2008-05-04
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
7楼2010-05-06 10:42:49
8楼2010-05-06 10:45:49
雪山飞狐7233
铁杆木虫 (著名写手)
铁杆小虫
- BioEPI: 9
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 18826.4
- 散金: 209
- 红花: 44
- 帖子: 1530
- 在线: 199.1小时
- 虫号: 593313
- 注册: 2008-09-05
- 性别: GG
- 专业: 化学计量学与化学信息学
9楼2010-05-06 13:12:22
10楼2010-05-06 13:13:07
40