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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于菌落PCR
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weiminhb

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于菌落PCR 已有7人参与

最近做转化，然后挑转化子，培养后做菌落PCR，总是假阳性，不能扩增出目标条带。想请教下，菌落PCR结果准吗？要不要将转化子接LB液体提质粒后再做PCR鉴定啊？
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1楼 2010-04-19 21:26:18
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-19 22:58
提取质粒后酶切结果最可靠，起码应该做一两次，验证一下菌落PCR的结果，菌落PCR特别容易污染，有的时候扩增失败也是常事
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2楼2010-04-19 21:27:54
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
这样啊，谢谢指教，我试试吧
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3楼2010-04-19 21:29:14
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌落PCR不如提取质粒后再P的好
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见得多爱的多
4楼2010-04-19 22:07:55
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1): 2010-04-19 23:01
我一般做的还好 用M13 Forward Primer和特异的Reverse Primer 基本都能得到目的条带
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尔非我焉知我悲喜
5楼2010-04-19 22:59:18
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hui_student

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-19 23:02
直接菌落PCR应该可以，LB固体平板，挑半个菌落行菌落PCR，等出结果且确定正确后在将剩余半个菌落扩增提质粒做后续实验比较好。直接扩菌提质粒，如果所选菌不正确的话，提质粒即费时又费试剂盒。
再有，您帖子里说的应该不是假阳性吧，假阳性是重组子未进入感受态细菌，但是扩曾出目的带，你现在没有出带，应该考虑是否是平板抗生素是否还有效，能否起到删选作用等。
希望有所帮助。
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一路前行！
6楼2010-04-19 23:00:23
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547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用载体的引物和插入片段的引物PCR，加入pfu 高保真酶，做好对照。
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为什么
7楼2010-04-20 13:08:49
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ydniu

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 547star at 2010-04-20 13:08:49:
用载体的引物和插入片段的引物PCR，加入pfu 高保真酶，做好对照。

就是鉴定一下，有必要用pfu吗？
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8楼2010-04-20 14:11:07
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